石榴叶总鞣质对正常和肥胖模型小鼠糖脂吸收的影响△

蒋鑫，王欣佩，雷帆*，余煊，邢东明，谢伟东，杜力军

(1.清华大学 生命科学学院医学院 药物药理实验室，北京 100084；2.清华大学 深圳研究生院 生命科学与健康学部，深圳 518055)

·基础研究·

石榴叶总鞣质对正常和肥胖模型小鼠糖脂吸收的影响△

蒋鑫1，2，王欣佩1，雷帆1*，余煊1，邢东明1，谢伟东2，杜力军1

(1.清华大学 生命科学学院医学院 药物药理实验室，北京 100084；2.清华大学 深圳研究生院 生命科学与健康学部，深圳 518055)

目的：石榴叶总鞣质(PLT)具有降低高糖高脂模型动物以及单纯性肥胖动物模型血中三酰甘油(TG)的作用。方法：为深入研究其降脂作用机理，在给予小鼠一定量的PLT后不同时间一次性灌胃橄榄油，测定血中TG浓度变化与时间的关系。结果：实验结果显示，提前0.5 h灌胃PLT可以显著降低正常小鼠和肥胖小鼠口服橄榄油所致的血中TG水平上升，但是对于腹腔注射橄榄油引起的TG升高没有作用，鞣酸可以抑制口服和灌胃橄榄油引起的TG升高；提前2 h给予PLT对于复合橄榄油引起的TG的升高作用不明显，但是可以降低血中总胆固醇(TC)和血糖的浓度，鞣酸可以降低复合橄榄油引起的TG、TC和血糖的升高。结论：总之，PLT可以显著减少肠道脂质的吸收，起到降脂减肥的作用。PLT中的鞣酸为其主要有效成分。

石榴叶总鞣质；脂质吸收；鞣酸；降脂作用

石榴的皮、叶、果皮、果汁中都含有丰富的鞣质类成分[1]。本课题组研究成果表明，石榴叶中的鞣质类成分具有降低高血糖合并高血脂大鼠的总胆固醇(TC)和总三酰甘油(TG)作用，据研究其作用可能和鞣酸质类物质抑制肝脏HMG-COA还原酶活性相关[2]；在高热量饮食诱导的单纯性肥胖小鼠模型上，石榴叶鞣质表现出显著的减肥降脂的作用[3]。此外，临床研究表明石榴提取物与他汀类药物合用具有更好的降低血脂和抗动脉粥样硬化作用[4]。为深入研究石榴叶总鞣质(PLT)降脂作用的药理作用靶点和主要活性成分，参考相关实验[5]进行设计，观察一次性给予PLT和鞣酸对小鼠胃肠道吸收TG能力的影响，以探讨PLT减肥的作用机理及作用方式，为后续研究奠定基础。

1 材料

1.1 动物

雄性ICR小鼠，体重：(20.03±1.97)g(北京维通利华实验动物技术有限公司)，合格证号：SCXK(京)2007-0003。

1.2 试剂

PLT(本室自制，批号：080203)；鞣酸(Garlic)；TG试剂盒、TC试剂盒和葡萄糖试剂盒(北京中生生物工程高技术公司，批号：20101207)；食用橄榄油；复合橄榄油：蛋黄体积分数为0.05%，淀粉体积分数为0.05%，橄榄油体积分数为50%，0.9%氯化钠溶液体积分数为49.9%，匀浆器调匀。药用淀粉(同仁堂制药有限公司)。

1.3 仪器

550 Microplate Reader(Bio-rad)。

2 方法

2.1 PLT和鞣酸对正常小鼠脂质吸收的影响

小鼠18只，随机分为3组，每组6只，分别为空白对照组、PLT组(800 mg·kg-1)和鞣酸组(200 mg·kg-1)。禁食12 h后给予同体积PLT、鞣酸和蒸馏水(空白对照组)，0.5 h后每只小鼠眼底静脉丛采血0.2 mL，随后一次性灌胃给予食用橄榄油(5 mL·kg-1)。分别在第1、2、4、6 h眼底静脉丛采血，每次0.2 mL，3000 r·min-1离心5 min，取血清，用试剂盒测定血样品中的TG和血糖含量。小鼠在实验期间可自由饮水但不进食。计算不同时间血液中TG浓度，做出时量曲线，进行统计学分析。

2.2 PLT长期给药对肥胖小鼠脂质吸收的影响

用高脂饲料造成单纯性肥胖模型小鼠12只，按照体重随机分为两组，一组给予蒸馏水灌胃，另一组给予PLT(800 mg·kg-1)灌胃。给药6周后，单纯性肥胖模型小鼠的平均体重为(39.9±2.77)g，给PLT组肥胖小鼠体重为(30.48±2.45)g；同批次饲喂普通饲料的空白对照鼠6只，体重(33.65±2.01)g。按照2.1中方法处理，一次性灌胃给予食用橄榄油(5 mL·kg-1)后，不同时间采血分离血清，进行血脂和血糖含量测定。计算不同时间血中TG、TC和葡萄糖浓度(mmol·L-1)，做出时量曲线。

2.3 PLT和鞣酸给药后不同时间对小鼠脂质吸收的影响

2.3.1 给药后0.5 h对小鼠肠道TG吸收的影响 小鼠分为5组，分别为：第1组，模型对照组，口服等体积0.9%氯化钠溶液；第2组，鞣酸对照组，给药剂量为800 mg·kg-1；第3、4、5组为PLT高、中、低剂量组，灌胃给药剂量分别为800、400、200 mg·kg-1，给药体积20 mL·kg-1。各组给药0.5 h后口服或腹腔注射食用橄榄油(10 mL·kg-1)。分别于口服或腹腔注射橄榄油后1、2、4、6 h眼眶采血。分离血清，用试剂盒测定其中TG含量。给药前采血作自身对照。做血中TG的时量曲线，并进行统计学分析。

2.3.2 提前给药2 h对小鼠TG吸收的影响 按照2.3.1中的方法进行分组，各组给药2 h后，随后给食用橄榄油(10 mL·kg-1)。分别于口服橄榄油后1、2、4、6 h眼眶采血。分离血清，备测。给药前采血作自身对照。做出血中TG的时量曲线，并进行统计学分析。

2.3.3 给药2 h后对小鼠肠道营养吸收的影响 给药2 h后，用复合橄榄油代替食用橄榄油进行灌胃，剂量为10 mL·kg-1。按照2.3.2的方法进行实验，检测血中的TG、TC和葡萄糖的含量，做出时量曲线，并进行统计学分析。

2.4 数据分析

3 结果

3.1 PLT和鞣酸可抑制正常小鼠对TG的吸收

给予食用橄榄油后小鼠血中TG浓度呈现先上升后下降的趋势，大约在第2小时达峰值。从第1小时开始，PLT组和鞣酸组的小鼠血中TG浓度显著低于空白对照组，并持续到第6小时。通过对各个曲线上升部分和下降部分数据的直线拟合发现，正常小鼠对脂质吸收最快(拟合直线斜率为4.01)，TG自血中消除速率也最快(曲线下降段拟合直线斜率为-0.99)。PLT和鞣酸对脂质吸收速度具有一定抑制作用，曲线上升段拟合直线斜率相近，分别为1.51和1.79；同时，其还抑制TG自血中消除，消除段速率较正常小鼠慢50%左右，斜率为-0.53；鞣酸组小鼠体内TG消除速度最慢，拟合直线斜率为-0.23。这一结果显示给予PLT和鞣酸可以抑制小鼠对TG的吸收，0～6 h TG总吸收量(图1中各曲线下面积)为：PLT组(16.26)<鞣酸组(22.89)<空白对照组(38.81)。其中PLT可抑制58%的TG吸收入血，鞣酸的抑制率为41%。结果见图1、表1。

小鼠血中TC浓度在实验过程中持续降低，给药组和空白对照组没有显著差异。第2小时鞣酸组和PLT组血中葡萄糖显著低于空白对照组，说明PLT大剂量可显著抑制进食引起的血糖升高，但是对血糖的消除没有影响。结果见表2。

图1 一次性给予食用橄榄油后给药组小鼠血中TG浓度随时间变化图

表1 灌胃食用橄榄油后小鼠血中TG浓度曲线上升段和下降段线性拟合回归方程

注：Y表示血中TG浓度(mmol·L-1)，X表示口服食用橄榄油后时间(h)。

表2 一次性给予食用橄榄油后小鼠血中TC和葡萄糖浓度经时变化 /mmol·L-1

注：与空白对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；下同。

3.2 PLT抑制肥胖小鼠TG的吸收

长期给PLT的肥胖组小鼠，给予食用橄榄油后，小鼠血中TG浓度迅速上升，在2 h达峰值，然后缓慢下降。肥胖模型组小鼠血中TG的含量显著高于正常对照组，说明肥胖小鼠可显著增加对食物中TG的摄取。6 h小鼠吸收入血的TG总量为：高脂模型组(23.52 mmol·L-1)>PLT高剂量组(18.51 mmol·L-1)>空白对照组(14.67 mmol·L-1)，其中石榴叶大剂量对TG吸收的抑制率为21.3%。见图2。

注：与高脂模型组小鼠相比，*P<0.05；**P<0.01。图2 一次性给予食用橄榄油后各组小鼠血TG浓度随时间变化图

3.3 给药时间对小鼠血脂吸收的影响

3.3.1 给药后0.5 h口服食用橄榄油 从图3中可以看出，提前0.5 h给予不同浓度的PLT和鞣酸，可以显著降低口服食用橄榄油后小鼠血中TG水平的升高，验证了上面的实验结果。但是，对于腹腔注射食用橄榄油，PLT不具有降低血中TG水平的作用，而鞣酸具有显著降低TG的作用，说明其作用机理与PLT作用机理不完全相同。

注：A.口服；B.腹腔注射。图3 给药0.5 h后口服或腹腔注射食用橄榄油血中TG的时量变化

3.3.2 给药后2 h口服食用橄榄油 从图4中可以看出，提前2 h给予鞣酸和不同浓度的PLT，再口服食用橄榄油对小鼠血中TG浓度变化影响不大，不同时间点TG浓度与对照组相比没有显著差异。而鞣酸组小鼠血中TG浓度时量曲线下面积(32.85)和PLT 800 mg·kg-1组(33.45)低于对照组(47.15)，说明鞣酸和PLT高剂量组提前2 h给药具有一定减少肠道吸收脂肪的作用。

3.3.3 给药后2 h口服复合橄榄油 从图5中可以看出，在食用橄榄油中增加胆固醇和淀粉类成分灌胃小鼠后，鞣酸组的小鼠血中TG、TC和葡萄糖的浓度与对照组相比显著降低，并随着时间的延长降低幅度越来越大。而给予不同剂量的PLT组小鼠，血中TG浓度与对照组差异不大，但是血糖和TC的浓度降低，其中400 mg·kg-1剂量组降低效果最好。

图4 给药2 h后口服食用橄榄油血中TG的时量变化

注：A.TG含量随时间变化图；B.TC随时间变化图；C.葡萄糖随时间变化图。图5 给药2 h灌胃复合橄榄油后小鼠血TG、TC、葡萄糖的时量变化图

4 讨论

早在20世纪90年代，在临床上治疗肥胖病人时发现肥胖症患者食用低脂肪含量的饮食较仅控制卡路里饮食更能减重，并有利于低体重的维持[6]。研究表明，患者体重降低和食物中脂肪含量降低呈正相关，降低食物中10%脂肪摄入量可以使肥胖者平均减重5～10 kg[6-8]。实验表明，给予相同量的食用橄榄油，3 h内肥胖小鼠吸收入血的TG为正常小鼠的170%，而且消除速度为正常小鼠的3倍左右(消除相斜率之比)，这也许就是肥胖患者限制饮食减肥效果依然不好或减肥后反弹的原因之一。PLT可以降低正常小鼠和肥胖小鼠的脂质吸收率，降低比例分别达到58%和21.3%，说明PLT与食物同时进食时阻碍了食物中脂肪的吸收。虽然长期给予PLT不能改变肥胖小鼠已经发生的消化系统病理生理改变，和肥胖模型组比对脂质吸收和从血中消除的速率没有太大影响，但是其可以显著抑制餐后血脂的持续增高，降低每餐总脂质吸收量。因此，PLT的这种作用有助于改善肥胖者的餐后高血脂症状，缓解过高的血脂对肝脏和血管壁等组织器官的损伤，降低动脉粥样硬化的风险。此外，根据本实验结果，PLT还可抑制给予复合橄榄油后TC和血糖的上升，说明PLT还可以抑制TC和血糖的上升。这可能是其减肥和改善高血脂症状的机理之一。已上市的减肥药奥利司他[9]就是通过抑制胰脂肪酶抑制肠道脂肪吸收而发挥减肥作用的药物。

鞣质是广泛存在于植物中的一类多酚类化合物，其可以和蛋白质相结合，从而使得蛋白质发生变性，最早用于皮革的鞣制[10]。现代研究发现，鞣质具有清除氧自由基、抗氧化[11]、抗菌、抗病毒[12]、改善肾功能[13]、抑制肠道对食物中脂肪的吸收、减慢肠蠕动速度、延长食物在肠道中停留时间[14]、降糖降脂等多种药理活性。石榴中的鞣质类成分主要是可水解鞣质，水解后生成多酚酸类化合物，本实验中口服PLT和鞣酸可以产生相似的药理作用。分别给予PLT和鞣酸后，灌胃食用橄榄油，小鼠血中TG浓度显著低于正常对照，对二者血脂和时间曲线上升段进行直线拟合后发现斜率类似，也就是给予PLT和鞣酸后小鼠肠道脂质吸收速度相似，说明PLT抑制脂质吸收作用可能与其中含有的鞣酸类物质有关。当进食富含脂质、胆固醇和碳水化合物的复合饮食后，PLT和鞣酸都可以降低血中TC和葡萄糖的浓度，说明二者对胆固醇和血糖的代谢具有促进作用，降低TC和血糖。从促进营养物质代谢的角度来讲，鞣酸类物质可能是PLT的主要有效成分。但是，鞣酸和PLT的药理作用也存在不一致的地方，主要表现在降脂的作用机理上，PLT只有在提前0.5 h给药才有效，说明其主要抑制了肠道脂质吸收。而鞣酸可以降低直接腹腔注射橄榄油的TG量，以及给药2 h后还具有降低血脂的作用，说明了鞣酸可以进入血液循环，可加快TG的体内代谢过程。二者降脂作用的不同可能是由于鞣质类物质难以被肠道吸收，只有水解成为鞣酸才能被肠道吸收，因此，PLT在肠道的作用占主要部分，而鞣酸被吸收入血，发挥影响营养物质代谢的作用。

PLT可以显著抑制小鼠肠道脂质的吸收，总鞣质中含有的鞣酸类物质可吸收入血，加速血中TG、胆固醇和葡萄糖的消除。PLT可以抑制肠道TG吸收和餐后持续的血脂、血糖升高，主要活性物质为鞣酸类化合物。

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EffectofTotalTenninsofPomegranateLeafonGlycolipidAbsorptioninNormalandObeseMice

JIANGXin1，2，WANXinpei1，LEIFan1*，YUXuan1，XINGDongming1，XIEWeidong2，DULijun1

(1.LaboratoryofMolecularPharmacologyandPharmaceuticalSciences，SchoolofLifeSciencesandSchoolofMedicine，TsinghuaUniversity，Beijing100084，China；2.ShenzhenKeyLabofHealthScienceandTechnology，DivisionofLifeScience&Health，GraduateSchoolatShenzhen，TsinghuaUniversity，Shenzhen518055，China)

Objective：Pomegranate leaf tanninnes(PLT)has been found to decrease the blood triglycerides in hyperlipidemia and obesity animal models.Methods：To explore the mechanism of the lipid-lowering effect of PLT，mice were given same amount of olive oil，0.5 or 2 hours after administering different doses of PLT and tannic acid.Blood concentration of triglyceride was measured at a certain time intervals，and the relationship between the blood triglyceride concentration and time was analyzed.Results：Results show that PLT significantly inhibited the increased concentration of triglyceride both in normal and obese mice induced by an oral administration of olive oil，but showed no effect on blood triglyceride level caused by intraperitoneal injection of olive oil.While，tannic acid could inhibit the TG increase caused by olive oil both in oral and injected administration.Administered 2 hours in advance，PLT could inhibit the glucose and the cholesterol level raised，caused by compound olive oil，but had no effect on TG level.Tannic acid could reduce TG，TC and glucose levels after composite olive oil administration in the same condition.Conclusion：Therefore，we can conclude that PLT can significantly reduce the intestinal lipid absorption，while，tannic acid can increase the blood triglyceride，cholesterol and glucose elimination from blood.

Pomegranate leaf tannins；fat metabolism；tannic acid；lipid-lowering effect

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.4.007

2015-04-20)

国家自然科学基金(30801523，81374006)；“重大新药创制”科技重大专项(2011ZX09101-002-11，2012ZX09103-201-041)

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雷帆，讲师，研究方向：中药药理学和分子药理学；Tel：(010)62798546，E-mail：leifan@tsinghua.edu.cn