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猪流行性腹泻病毒的特性研究

2016-09-24王靓靓白会新

猪业科学 2016年6期
关键词:滴度流行性支原体

王靓靓,张 艳,白会新 

(1. 大庆市畜牧兽医局,黑龙江 大庆 163311;2.黑龙江省兽医科学研究所,黑龙江  齐齐哈尔  161000)

猪流行性腹泻病毒的特性研究

王靓靓1,张 艳2,白会新1

(1. 大庆市畜牧兽医局,黑龙江 大庆 163311;2.黑龙江省兽医科学研究所,黑龙江  齐齐哈尔  161000)

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) 引起的一种严重的病毒性传染病。对于大多数的病毒性腹泻疾病来说,防治措施一般选择疫苗免疫。近年来,有关猪流行性腹泻病毒疫苗的研究已经取得了一定的进展,包括灭活疫苗、弱毒疫苗、转基因植物疫苗、乳酸杆菌疫苗、亚单位疫苗和联合疫苗等。实验参照2010年版《中华人民共和国兽药典》第3部的要求对该病毒的特性进行了系统研究与记录,为PEDV HLJBX株可作为弱毒疫苗候选株的研究提供了进一步的参考资料。

猪流行性腹泻病毒;种毒;疫苗

猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV) 引起的一种严重的病毒性传染病。该病的特征是可以导致哺乳仔猪发生严重的腹泻、呕吐、脱水,并且致死率极高。实验室常用微量血清中和试验[1]、免疫电镜法(IEM)[2]、免疫荧光法(FAT)[3]、酶联免疫吸附试验(ELISA)[4]、双抗体夹心ELISA[5]、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)[6]和RT-LAMP技术[7]等技术手段检测该病。本文参照《中华人民共和国兽药典》2010年版第3部的要求,通过对PEDV HLJBX毒株的纯粹检查、滴度的测定和理化特性等生物学特性进行研究记录,为下一步疫苗开发奠定基础。

1 试验材料

1.1毒株、细胞系和引物

PEDV HLJBX株由东北农业大学预防兽医学实验室分离并保存,非洲绿猴传代肾细胞(Vero)细胞系本实验室保存。猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒(PCV)鉴定引物均由东北农业大学预防兽医学实验室设计并由博仕生物公司合成。

1.2试剂

DMEM培养液,犊牛血清,RNA提取试剂盒,PEDV阳性血清,鼠抗PEDV全病毒抗体,FITC标记的羊抗鼠酶标抗体,葡萄糖蛋白胨培养基(G.P)、硫乙醇酸盐培养基(TG)和支原体培养基均由本实验室配制。

2  实验方法

2.1种毒的纯粹检查

2.1.1无菌检测

在已经配好的硫乙醇酸盐培养基(T.G)和葡萄糖蛋白胨培养基(G.P)中接种PEDV,每种培养基各接2只试管,每管l mL。分别置于37 ℃和25 ℃条件下培养7 d,对照管接种无菌生理盐水。每天观察记录结果。

2.1.2支原体检测

在支原体半流体培养基和肉汤培养基中接种PEDV种毒,每种培养基接种4支,每支0.5 mL。置 37℃培养14 d,每3 d观察一次,阴性对照为生理盐水,阳性对照为肺炎支原体。

2.1.3外源病毒检验

按照提取总RNA和DNA试剂盒的说明提取种毒液的RNA和DNA,将提取的RNA反转录为cDNA,将反转录的产物使用猪轮状病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒(PCV)相应上、下游引物及反应条件进行PCR扩增。反应结束后,用1%琼脂糖凝胶电泳检测结果。

2.2种毒的理化特性

2.2.1热稳定性实验

取5管PEDV病毒,离心去细胞碎片,一管作为对照组放于4 ℃, 保存30 min,其余4管分别置于37 ℃、42 ℃、50 ℃、65 ℃,30 min水浴,然后把实验组和对照组均接种在长满Vero细胞的96孔板中进行TCID50测定。

2.2.2pH稳定性实验取2管PEDV,一管作为对照组,

另一管用HCl调至pH=3,37 ℃作用1 h后,再调回pH为7.2~7.4,将对照组和实验组分别接种在长满Vero细胞的96孔板中,进行TCID50测定。

2.2.3氯仿敏感性实验

取2管PEDV,一管加入氯仿,使其终浓度为4.8%,振荡混匀,2 500 r/ min离心5 min,取上清,另一管加DMEM作对照,测定两组病毒的TCID50。

2.3种毒滴度的测定

采用96孔板进行测定。首先将细胞进行消化,分装到96孔板内,待细胞长满80%时,弃去DMEM液,用PBS洗3次,将病毒稀释成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7,10-8,10-9,10-1010个稀释度,每一稀释度接种5孔细胞,接种量为100 μL/孔,并设立一行作为细胞对照,在接毒后72 h,判定细胞病变,当病变细胞在80%以上时,判定为病变细胞孔,进行TCID50的测定。按公式计算(Reed-Muech 氏法计算)。

表1 细菌和霉菌检测结果

表2 PEDV支原体检测结果

病毒稀释度 孔数  无CPE孔数有CPE孔数  累计总数 CPE孔比例  出现CPE率/% 无CPE孔  有CPE孔10-1 5 0 5 0 28 28/28 100 10-2 5 0 5 0 23 23/23 100 10-3 5 0 5 0 18 18/18 100 10-4 5 0 5 0 13 13/13 100 10-5 5 0 5 0 8 8/8 100 10-6 5 2 3 2 3 3/5 60 10-7 5 5 0 7 0 0/7 0 10-8 5 5 0 12 0 0/12 0 10-9 5 5 0 17 0 0/17 0 10-10 5 5 0 22 0 0/22 0接种细胞

3 结果与分析

3.1细菌和霉菌检测结果

对PEDV种毒进行检测,未见细菌、霉菌污染(见表1)。

3.2支原体检测结果

用以下2种培养基对PEDV种毒进行检测,均未见支原体污染(见表2)。

3.3外源病毒检测结果

对PRV、PRRSV、TEGV、PPV 和PCV的检测结果,全部呈阴性,证明PEDV没有这几种外源病毒的污染(见图1)。

3.4理化特性结果

3.4.2热稳定性实验结果

病毒在50 ℃及以上温度处理30 min就会失去感染细胞的能力,滴度大幅度下降,而37 ℃下作用30 min对病毒滴度没有影响(见图2)。

3.4.2pH稳定性实验

将PEDV的pH调至3时,病毒的滴度变化不大,说明PEDV的PH较为稳定(见图3)。

图1 外源病毒的检测

图2 PEDV热稳定性实验

图4 PEDV的氯仿敏感性实验

3.4.3氯仿敏感性实验

加入终浓度为4.8%的氯仿,实验组的TCID50与对照组的对数差值大于2,表明PEDV对氯仿敏感(见图4)。

3.5种毒库病毒滴度的测定

采用96孔板进行测定,在接毒后72 h,判定细胞病变,当病变细胞在80%以上时,判定为病变细胞孔,进行TCID50的测定。按公式计算(Reed-Muech 氏法计算),结果见表3。

其确切稀释倍数可按下列公式计算:

将由上式获得的0.17加在高于 50%死亡的稀释度的对数(6)上,因此该病毒的 TCID50应是10-6.17/0.1 mL。

4 讨论

随着PED在许多国家的暴发,很多国内外学者都一直在研究PEDV的培养特性,希望可以通过PEDV的体外培养和PEDV感染细胞受体等多方面的研究来进行PEDV的大量繁殖,可以为PEDV的疫苗研制提供重要的物质基础。有报道称适应细胞培养的PEDV 经60 ℃或以上处理30 min失去感染力,但在50℃条件下相对稳定,病毒在4 ℃、pH 5.0~9.0以 及37 ℃、pH 6.5~7.5时稳定,经超声波处理或多次反复冻融后,病毒感染力不受影响,这些都与本实验结果相符。Kusanagi等[8]报道PEDV 对乙醇和氯仿敏感。这些研究成果只是一部分PEDV毒株的理化特性,并没有针对性。本实验通过对PEDV HLJBX毒株的理化特性的研究显示,PEDV对热敏感,若在50 ℃温度下作用30 min,就会失去了感染力,可达到热灭活的效果。pH稳定性试验显示,病毒的滴度变化不大。

[1] 邓芳.猪流行性腹泻预防及诊断研究进展[J].畜禽业,2015 (3):19-20.

[2] 照日格图,李志国,王振普. 猪流行性腹泻的诊断技术及预防策略[J].北方牧业,2013 (13):18.

[3] 林志雄,黄引贤,李树根,等.应用直接免疫荧光法检测猪流行性腹泻病毒的研究[J].中国进出境动植检,1997 (2):32-34.

[4] 华耀,王玮,李郁,等. 猪流行性腹泻病毒S蛋白主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA检测方法的建立[J]. 微生物学通报,2016,43(2):434-443.

[5] 李一经,刘博,姜艳平,等. 双抗体夹心ELISA检测排泄物PEDV[J]. 东北农业大学学报,2015,46(2):1-10.

[6] 孟凡伟,张雪,王俊,等. 猪流行性腹泻病毒Real-time PCR检测方法的建立[J].中国农学通报,2014,30(5):41-45.

[7] LI PREN X.Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of transmissible gastroenteritis virus[J].Curr Microbiol,2011,62(3):1074-1080.

[8] KUSANAGI K,KUWAHARAR H,KATOH T,et al.Isolation and serial propagation of porcine epidemic diarrhea virus in cell cultures and partial characterization of the isolate[J].Vet Med Sci,1992,54(2):313-318.

2016-04-08)

黑龙江省教育厅新世纪优秀人才基金资助项目(1155-NCET-005);黑龙江省高校科技创新团队基

金资助项目(2011TD001);国家自然科学基金资助项目(31201911;31200122)

王靓靓(1987-),女,兽医硕士,兽医师,主要从事工作:动物卫生监督和疫病防控

白会新

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