红鳍东方鲀SREBP-1和SREBP-2基因克隆及表达分析

张　伟,姬明丽,郭前进,千智斌

(新乡医学院 基础医学院,河南 新乡　453003)



红鳍东方鲀SREBP-1和SREBP-2基因克隆及表达分析

张伟,姬明丽,郭前进,千智斌

(新乡医学院 基础医学院,河南 新乡453003)

为了研究红鳍东方鲀SREBP-1和SREBP-2基因的功能及在脂肪代谢中的分子机制,从红鳍东方鲀脂肪组织提取总RNA,反转录获得cDNA模板,利用设计的引物PCR扩增获得SREBP-1和SREBP-2开放阅读框(ORF),SREBP-1基因ORF区的cDNA序列长度为3 330 bp,编码1 109个氨基酸,SREBP-2基因ORF区的cDNA序列为3 444 bp,编码1 147个氨基酸。实时荧光定量PCR检测SREBP-1基因在红鳍东方鲀不同组织中的表达特征,结果表明,SREBP-1在脑组织中表达丰度最高,其次为眼、脂肪组织、肠、鳃、脾脏、心脏及肝脏,在肌肉中表达丰度最低。将SREBP-1连接到原核表达载体pET32a上,利用IPTG对重组质粒pET32a-SREBP-1在大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达,SDS-PAGE电泳显示在141 kDa处有特异性的条带出现。

红鳍东方鲀;SREBP-1基因;SREBP-2 基因;原核表达

固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)是一类含有碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链(bHLH-zip),参与调控脂肪酸、胆固醇和甘油三酯合成与吸收的重要转录因子,对脂质稳态维持起着重要的作用[1]。SREBPs家族包含SREBP-1和SREBP-2这2个基因,分别位于17,22号染色体上[2]。SREBP-1基因因各自不同启动子的选择性剪切形成2个剪切体,分别为SREBP-1a和SREBP-1c,两者的氨基酸序列长度不同,SREBP-1c的序列较长。SREBP-2 基因定位于22号染色体,其结构上有一段较长酸性激活域[3],并与SREBP-1a酸性激活域的结构较为相似。Hua等[4]研究发现,SREBP-1和SREBP-2蛋白的结构较为相近,有40%～50%的同源性,物种间也有差异。SREBP-1c是调节脂肪代谢的重要核内转录因子,其主要在肝细胞和脂肪细胞中表达,同时在脂肪细胞分化中有着至关重要的作用[5]。SREBP-1在动物的各种组织中都有表达,如小鼠和人的肌肉中[6],以及禽类的肠道及脂肪组织等[7]。SREBP-1作为转录因子家族SREBPs的成员之一,研究证实其通过调控FoxO1、PPARγ等脂肪代谢相关基因的表达,从而调节脂肪代谢的机制。

目前,对于鱼类SREBP的研究开展的工作较少,笔者所在课题组之前对红鳍东方鲀SREBP-1进行了电子克隆及生物信息学分析[8]。本研究克隆了红鳍东方鲀SREBP-1、SREBP-2 基因完整的ORF序列,检测SREBP-1基因在不同组织的表达,并进行原核表达,为深入研究SREBP基因调控脂肪代谢的分子机制奠定了基础。

1　材料和方法

1.1试验材料

供试动物为红鳍东方鲀,取材时将其放在冰上麻醉,取出脑、眼、脂肪组织、肠、鳃、脾脏、心脏、肝脏、肌肉组织9个组织,用灭菌的DEPC处理水冲洗后,在液氮速冻1 h后取出,-80 ℃保存备用。

1.2SREBPs基因的电子克隆

SREBP-1基因的电子克隆已完成[8]。以大黄鱼SREBP-2的氨基酸序列(KKF13222.1)为探针在河豚的基因组数据库(http://genome.jgi-psf.org/Takru4/Takru4.home.html)中进行Blast分析,搜索到与已知的SREBP-2 存在相似性的片段作为红鳍东方鲀SREBP-2 的预测基因。

1.3SREBP-1和SREBP-2 ORF的克隆

利用TRIzol试剂(Invitrogen公司,美国)从肝脏组织抽提总RNA,以总RNA为模板,利用SuperScript Ⅲ reverse transcriptase(Invitrogen公司,美国)合成cDNA第1条链。根据电子克隆获得的SREBP-1、SREBP-2基因序列,在ORF区两端设计引物见表1,RT-PCR扩增条件为：94 ℃变性40 s,60 ℃退火40 s,72 ℃延伸90 s,总计35个循环,最后72 ℃充分延伸10 min。将PCR产物连接于pGEM T-easy载体(Promega公司,美国),连接产物转化大肠杆菌JM109,阳性克隆抽提质粒,送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.4生物信息学分析

在NCBI网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi进行蛋白质结构域在线分析。利用DNAStar软件中的Editseq程序对核苷酸和氨基酸序列进行理化性质分析。程序进行同源性分析。利用Mega 5.05软件建立不同物种SREBP氨基酸序列的分子系统进化树。

1.5实时荧光定量PCR检测SREBP-1基因在不同组织的表达

以9种组织的总RNA反转录获得的cDNA为模板,利用SYBR Green染料法相对定量SREBP-1基因在不同组织的相对表达水平。根据SREBP-1 ORF区范围内设计引物qSREBP1-F和qSREBP1-R(表1)用于RT-qPCR,以β-actin为内参进行表达差异研究。Real-time PCR程序如下：95 ℃ 5 min进行预变性;95 ℃ 10 s,58 ℃ 10 s,72 ℃ 20 s,进行40 个循环。反应在IQ 5 Real-time System 荧光定量PCR仪上进行,每个cDNA样品重复3次,利用2-ΔΔCt相对定量法计算相对表达量。

表1　引物序列

1.6原核表达载体的构建及鉴定

利用带有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的引物SREBP-1-EcoRⅠ和SREBP-1-SalⅠ(表1)扩增红鳍东方鲀SREBP-1基因ORF序列,与pGEM-T Easy载体连接,转化到大肠杆菌。pGEM-T-SREBP-1和pET32a质粒采用EcoRⅠ和SalⅠ进行双酶切3 h,琼脂糖凝胶电泳切胶回收目的条带和载体,用T4DNA连接酶过夜连接后转化到JM109大肠杆菌。将菌落PCR和双酶切鉴定阳性的克隆,进行测序验证。

1.7目的蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测

对pET32a-SREBP-1重组质粒转化到Rosetta(DE3)大肠杆菌中,在平板上随机挑取克隆进行菌落PCR鉴定阳性克隆接种到含氨苄青霉素的LB液体培养基,37 ℃过夜振荡培养,按1∶50的比例转接到20 mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中,振荡培养至OD值为0.6～0.8时,加入IPTG至终浓度为1 mmol/L,37 ℃诱导5 h后离心进行菌体的收集,利用超声波破碎,4 ℃、12 000 r/min离心20 min,收集上清。把PBS缓冲液加到沉淀组分中悬浮。将上清和沉淀测定浓度,SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。

2　结果与分析

2.1SREBP基因的序列测定和分析

根据电子克隆得到的序列设计引物,经RT-PCR扩增后,电泳检测到3 330,3 444 bp的目的条带(图1),符合预期红鳍东方鲀SREBP-1、SREBP-2 基因的ORF区的大小。测序结果表明SREBP-1、SREBP-2 基因序列的全长分别为3 330,3 444 bp。根据克隆得到的红鳍东方鲀SREBP-1、SREBP-2 基因ORF区的序列利用DNASTAR软件推测其氨基酸序

M.DNA分子质量标准;1.SREBP-1;2.SREBP-2。

图2　红鳍东方鲀SREBP-2 基因cDNA序列及其推导的氨基酸序列

列,发现SREBP-1编码氨基酸为1 109个,与电子克隆结果一致[8],SREBP-2 编码1 147个氨基酸(图2),理论等电点为8.22,分子质量为125.53 kDa。对红鳍东方鲀SREBP-1和SREBP-2蛋白进行功能域的分析,其氨基端均有1个SREBPs家族的保守的结构域——碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链结构(bHLH-zip)。

将红鳍东方鲀SREBP-2蛋白的氨基酸序列与其他物种进行同源性分析,发现与大黄鱼的同源性最高为82%,与尼罗罗非鱼、青鳉的同源性较高,分别为80%,76%。利用Mega 5.05以邻位相接(N-J)构建不同物种SREBP蛋白的分子系统进化树(图3)发现：分子进化树分为SREBP-1、SREBP-2两大支。SREBP-1又分为2个小支,红鳍东方鲀SREBP-1与其他鱼类聚为1支,另1支为哺乳动物类。红鳍东方鲀SREBP-1与黄斑蓝子鱼的亲缘关系最近,与哺乳动物亲缘关系较远。SREBP-2也分为2小支,1支为红鳍东方鲀SREBP-2与其他鱼类,另外1支为哺乳动物聚为另外1支。进化分析发现,红鳍东方鲀SREBP-2与大黄鱼的亲缘关系最近,与哺乳动物亲缘关系较远。

图3　红鳍东方鲀SREBP与其他生物的系统进化树

2.2SREBP-1基因在不同组织的表达分析

利用RT-qPCR技术对SREBP-1在红鳍东方鲀的9种组织转录水平的表达分析进行检测,发现SREBP-1基因在脑中的表达量最高,其次是眼、脂肪组织、肠、鳃、脾脏、心脏及肝脏,在肌肉组织中的表达量最低(图4)。

2.3pET32a-SREBP-1重组表达质粒的鉴定

用EcoRⅠ和SalⅠ对重组表达质粒pET32a-SREBP-1进行双酶切鉴定(图5),1条为载体,1条为目的条带。测序结果表明,所测序列没有碱基缺失及变异,故初步确认所构建的pET32a-SREBP-1重组表达质粒是成功的,可以进行下一步试验。

2.4融合蛋白的表达与纯化

将重组质粒pET-32a-SREBP-1转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)并利用IPTG进行诱导5 h后,收集细菌并进行超声波破碎,利用SDS-PAGE电泳进行检测,发现IPTG诱导后pET-32a-SREBP-1,出现约141 kDa的蛋白条带(图6),与推测的相符。在上清中含有目的蛋白较多,故融合蛋白是可溶性的。

图4　SREBP-1基因的组织表达特性

M.DNA分子量标准；1.pET-32a-SREBP-1质粒双酶切。

M.蛋白分子量标准；1.纯化;2.沉淀;3.上清;4.总菌液;5.空白质粒。

M.Protein Marker;1.Purified recombinant SREBP-1 protein;2.Sedimentation;3.Supernatant;4.EscherichiacoliRosetta (DE3) contained pET32a are induced by IPTG;5.pET32a.

图6重组质粒表达产物的SDS-PAGE分析

Fig.6SDS-PAGE analysis of expression of the SREBP-1 in Rosetta (DE3)

3　结论与讨论

SREBPs有3种亚型：SREBP-1a调节所有SREBP的下游靶基因,主要调控脂肪酸,其次是胆固醇的合成;SREBP-1c主要是调节磷脂和甘油三酯的合成;SREBP-2主要调控胆固醇的合成[9-10]。哺乳动物的SREBP蛋白具有一个进化比较保守的功能域—bHLH-zip区域,是发生二聚化与DNA结合的区域[11]。生物信息学分析发现红鳍东方鲀的SREBP-1和SREBP-2蛋白的氨基端都存在bHLH-zip区,因此，推测可能具有调控脂肪代谢的功能。因为SREBP-1基因在物种上的差异及可选择的编码序列的不同有SREBP-1a、SREBP-1c等不同的变体的存在[12-14]。然而，在鱼类中只有SREBP-1基因[15]，该基因在鱼类调控脂肪代谢的分子机制是鱼类营养学中重要的研究课题[9,16-18]。但鱼类的SREBP-1基因否具有哺乳动物的SREBP-1a和SREBP-1c的功能还有待研究。

红鳍东方鲀组织表达分析发现SREBP-1在所有检测的组织中均有表达,在大脑组织中表达的最高。蓝子鱼SREBP-1基因在脑、眼和肠道中的表达量相对比较高[19]。大西洋鲑鱼SREBP-1基因在肠道的表达水平最高,其次是大脑和鳃[15]。哺乳动物SREBP-1a和SREBP-1c在组织中表达也有差异,SREBP-1c在脂肪组织中表达量最高,SREBP-1a是在肝脏中表达量最高[12]。研究表明,鸡SREBP-1基因主要在腹部脂肪和心脏中的表达量较高,而在肝脏、胃、脾脏、肾脏等组织中表达量较低[20]。由此可见,红鳍东方鲀SREBP-1基因的组织分布和鱼类的较为接近,尤其是黄斑蓝子鱼,与哺乳类动物有比较大的差异,可能因为鱼类合成脂肪酸的主要部位在大脑,而哺乳动物脂肪酸合成主要在肝脏和脂肪组织。

为了进一步研究SREBP-1蛋白的功能,将红鳍东方鲀SREBP-1基因克隆到原核表达载体pET-32a,成功构建了重组表达质粒pET-32a-SREBP-1,利用IPTG进行诱导在大肠杆菌中的表达。收集菌液进行超声波破碎,鉴定在上清和沉淀中是否有目的蛋白的表达。结果发现上清中的表达量较多,利用SDS-PAGE电泳技术进行鉴定发现表达后的融合蛋白的分子质量大约为141 kDa。pET-32a-SREBP-1重组质粒的构建及SREBP-1融合蛋向的成功表达为抗体的制备及深入研究SREBP-1蛋白的功能提供了基础的材料。

[1]Wei S,Espenshade P.Expanding roles for SREBP in metabolism[J].Cell Metabolism,2012,16(4):414-419.

[2]Bennett M K,Ngo T T,Athanikar J N,et al.Co-stimulation of promoter for low density lipoprotein receptor gene by sterol regulatory element-binding protein and Sp1 is specifically disrupted by the yin yang 1 protein[J].The Journal of Biological Chemistry,1999,274(19):13025-13032.

[3]Deng X,Cagen L M,Wilcox H G,et al.Regulation of the rat SREBP-lc promoter in primary rat hepatocytes[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2002,290(1):256-262.

[4]Hua X,Yokoyama C,Wu J,et al.SREBP-2,a second basic-helix-loop-helix-leucine zipper protein that stimulates transcription by binding to a sterol regulatory element[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1993,90(24):11603-11607.

[5]Jeon T I,Osborne T F.SREBPs:metabolic integrators in physiology and metabolism[J].Trends in Endocrinology & Metabolism,2011,23(2):65-72.

[6]Brown M S,Goldstein J L.The SREBP pathway:regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane-bound transcription factor[J].Cell,1997,89(3):331-340.

[7]Assaf S,Hazard D,Pitel F,et al.Cloning of cDNA encoding the nuclear form of chicken sterol response element binding protein-2 (SREBP-2 ),chromosomal localization,and tissue expression of chickenSREBP-1 and -2 genes[J].Poultry Science,2003,82(1):54-61.

[8]张伟,付云,张煜.红鳍东方鲀SREBP-1基因的电子克隆及生物信息学分析[J].广东农业科学,2014,41(17):119-123,241.

[9]Horton J D,Goldstein J L,Brown M S.SREBPs:activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver[J].The Journal of Clinical Investigation,2002,109(9):1125-1131.

[10]Tanaka N,Zhang X,Sugiyama E,et al.Eicosapentaenoic acid improves hepatic steatosis independent of PPARα activation through inhibition ofSREBP-1 maturation in mice[J].Biochemical Pharmacology,2010,80(10):1601-1612.

[11]Ma P C,Rould M A,Weintraub H,et al.Crystal structure of MyoD bHLH domain-DNA complex:perspectives on DNA recognition and implications for transcriptional activation[J].Cell,1994,77(3):451-459.

[12]Shimomura I,Shimano H,Horton J D,et al.Differential expression of exons 1a and 1c in mRNAs for sterol regulatory element binding protein-1 in human and mouse organs and cultured cells[J].The Journal of Clinical Investigation,1997,99(5):838-845.

[13]Felder T K,Klein K,Patsch W,et al.A novel SREBP-1 splice variant:tissue abundance and transactivation potency[J].Biochimica et Biophysica acta,2005,1731(1):41-47.

[14]Harada N,Yonemoto H,Yoshida M,et al.Alternative splicing produces a constitutively active form of human SREBP-1[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2008,368(3):820-826.

[15]Minghetti M,Leaver,M J,Tocher D R.Transcriptional control mechanisms of genes of lipid and fatty acid metabolism in the Atlantic salmon (SalmosalarL.) established cell line,SHK-1[J].Biochim Biophys Acta,2011,1811(3):194-202.

[16]Dong X,Xu H,Mai K,et al.Cloning and characterization of SREBP-1 and PPAR-α in Japanese seabassLateolabraxjaponicus,and their gene expressions in response to different dietary fatty acid profiles[J].Comparative Biochemistry and Physiology,Part B,2015,180(180C):48-56.

[17]Zheng J L,Luo Z,Zhu Q L,et al.Molecular cloning and expression pattern of 11 genes involved in lipid metabolism in yellow catfishPelteobagrusfulvidraco[J].Gene,2013,531(1):53-63.

[18]Pai W Y,Hu C C,Lai C Y,et al.Cannabinoid receptor 1 promotes hepatic lipid accumulation and lipotoxicity through the induction of SREBP-1c expression in zebrafish[J].Transgenic Research,2013,22(4):823-838.

[19]刘芳.黄斑蓝子鱼固醇调节元件结合蛋白-1基因克隆及表达研究[D].汕头:汕头大学,2011.

[20]王丽,那威,王宇祥,等.鸡SREBP1基因抗血清制备及组织表达特性分析[J].细胞与分子免疫学杂志,2010,26(12):1241-1245.

Cloning and Expression of SREBP-1 and SREBP-2 in Torafugu Takifugu rubripes

ZHANG Wei,JI Mingli,GUO Qianjin,QIAN Zhibin

(School of Basic Medical Science,Xinxiang Medical University,Xinxiang453003,China)

In order to study the function and molecular mechanism ofSREBP-1 andSREBP-2, the open reading frames (ORF) of torafuguSREBP-1 andSREBP-2 genes were amplified from total RNA of adipose tissue by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).The results showed that the ORF ofSREBP-1 was composed of 3 330 bp,encoding 1 109 amino acids,while the ORF ofSREBP-2 was composed of 3 444 bp,encoding 1 147 amino acids.The expression ofSREBP-1 gene in torafugu tissues was determined using Real-time quantitative PCR,presenting that the highest expression was in brain,followed in eye,adipose tissue,spleen,gill,intestine,heart and liver,but the lowest in muscle.The prokaryotic expression system of recombined vector pET32a-SREBP-1 was constructed successfully.SDS-PAGE analysis showed that the expressed protein accumulated and the molecular weight of expressed fusion protein was 141 kDa.

Takifugurubripes;SREBP-1 gene;SREBP-2 gene;Prokaryotic expression

2016-03-25

河南省教育厅重点项目(14A310027);新乡医学院高学历人才启动基金项目(505001)

张伟(1977-),男,河南长垣人,讲师,博士,主要从事鱼类脂质代谢的机制研究。

S917;Q786

A

1000-7091(2016)04-0074-06

10.7668/hbnxb.2016.04.013