绣球SSR-PCR反应体系的建立与优化

贾新平,孙晓波,梁丽建,邓衍明,苏家乐,周建涛

(江苏省农业科学院 园艺研究所,江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室,江苏 南京　210014)



绣球SSR-PCR反应体系的建立与优化

贾新平,孙晓波,梁丽建,邓衍明,苏家乐,周建涛

(江苏省农业科学院 园艺研究所,江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室,江苏 南京210014)

为了建立适合绣球的SSR-PCR反应体系,采用正交设计L25(56)对影响SSR-PCR反应体系的5个主要因素(Mg2+、dNTPs、引物、DNA模板和Taq聚合酶)在5个水平上进行优化,筛选出每个因素的最佳水平,建立适合绣球的SSR-PCR反应体系。结果表明,20 μL的SSR-PCR反应体系中,DNA模板用量为60 ng,Mg2+浓度为1.5 mmol/L,dNTPs浓度为0.3 mmol/L,引物浓度为0.4 μmol/L,Taq聚合酶用量为0.8 U。扩增程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,最佳温度退火40 s,72 ℃ 1 min,33个循环;72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。选用10个绣球品种对建立的SSR-PCR反应体系进行验证,结果表明该体系具有较好的稳定性和通用性。建立和优化的绣球SSR-PCR反应体系,为应用SSR分子标记技术开展绣球属植物遗传育种研究提供了理论依据和技术参考。

绣球;SSR-PCR;正交设计;反应体系

绣球(Hydrangeamacrophylla)又称八仙花、紫阳花,是虎耳草科(Saxifragaceae)绣球属(Hydrangea)植物,主要分布于亚洲东南部和南北美洲[1]。全世界绣球属植物约有73种,而我国是绣球属植物的主要分布中心,现有47种和11个变种,约占世界资源的63%[2]。绣球的花序、花型、花色非常丰富,叶大而具有光泽,既可观花又可观叶,是世界园林中非常重要的观赏植物。绣球在不良环境中表现出较强的适应能力,具有耐荫、耐寒、抗病虫害等优良特性[3]。绣球不仅具有较高的观赏价值和经济价值,还具有一定的药用价值[4]。因此,绣球作为一种观赏兼药用的优良观赏植物,在现代城市园林绿化中具有着广阔的应用前景。

简单重复序列(Simple sequence repeat,SSR)又称为微卫星DNA,该标记技术具有数量多、多态性丰富、共显性遗传、重复性好、易检测等优点,广泛应用于植物遗传育种研究[5-9],但在绣球属植物研究中应用相对较少。SSR标记是一种基于PCR的分子标记技术,在检测过程中易受PCR反应体系中多种因素的影响。目前,国内还未见关于绣球属植物SSR-PCR反应体系的研究报道,因此建立一套稳定、高效的SSR-PCR反应体系对于开展绣球研究很重要。本研究利用正交设计对SSR-PCR反应体系中的模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、Taq聚合酶这5个主要因素进行优化试验,筛选出各个因素的最佳水平,建立适合绣球的SSR-PCR反应体系。建立和优化的SSR-PCR反应体系,为利用SSR分子标记技术开展绣球属植物遗传育种研究提供理论依据和技术参考。

1　材料和方法

1.1试验材料

1.2生物试剂

SSR-PCR反应体系中的10×PCR Buffer、Mg2+、dNTPs、Taq聚合酶、DNA Marker、Loading Buffer,购自南京鼎国生物技术有限公司。

1.3基因组DNA提取与检测

利用CTAB法提取10个绣球品种的基因组DNA[10]。利用琼脂糖凝胶电泳对DNA质量进行检测,然后用微量分光光度计(Nano DropTMSpectrophotometer)测定DNA的纯度和浓度,根据A260/280比值判断DNA纯度。最后将DNA浓度稀释至100 ng/μL,于-20 ℃冰箱保存备用。

表1　供试绣球材料

1.4SSR-PCR反应体系正交试验设计

以大花绣球品种史欧尼的基因组DNA为模板,针对影响SSR-PCR反应的5个主要因素(Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、DNA模板量、Taq聚合酶量)进行优化试验。为明确这5个主要因素在SSR-PCR反应体系中的最佳水平,每个因素设置5个水平,每个因素的梯度设置见表2。采用正交设计L25(56)进行分析,实施方案见表3。PCR反应液中除表2中所列之外,还需加入10×PCR Buffer(不含Mg2+)2.0 μL,剩余用ddH2O进行补充,扩增体系总体积为20 μL。

1.5PCR扩增与检测

总而言之，情绪管理对于大班幼儿的心理健康成长有着极其重要的作用。文章先分析了大班幼儿的情绪特点，然后从营造良好情绪氛围、教会情绪管理方法、加强家园合作力度方面提出了大班幼儿情绪管理能力培养对策，以供其他幼儿教师参考借鉴。

PCR反应在Biometra T-Professional Thermocycler 仪上进行。扩增程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,最佳温度退火40 s,72 ℃延伸1 min,总共33个循环;72 ℃延伸10 min,最后4 ℃保存。反应结束后,扩增产物中加入2 μL Loading Buffer混匀,经1%的琼脂糖凝胶电泳检测,凝胶成像系统观察并拍照。每个组合设有3个重复,均在相同条件下进行PCR扩增和电泳检测。

表2　绣球SSR-PCR反应体系的因素与水平

表3　绣球SSR-PCR反应体系的正交试验设计L25(56)

1.6统计与数据分析

参照何正文等[11]的方法对PCR扩增的电泳结果进行统计,根据主带数量、非特异性带数量、清晰度和弥散程度4个因素,依次对每个处理组合进行评分。主条带扩增数越多、非特异性条带数越少、条带清晰度越强、弥散程度越小的评分值越高,反之评分值就越低;最高记为25分,最低记为1分。将试验结果输入SPSS 17.0统计软件进行方差分析。

1.7最佳SSR-PCR反应体系的验证

利用优化的绣球SSR-PCR反应体系,选取30对SSR引物对10个绣球试材进行PCR扩增,扩增产物经8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,验证该反应体系的稳定性和通用性。

2　结果与分析

2.1DNA提取及质量检测

利用CTAB法提取10份绣球试材的基因组DNA呈白色絮状、溶解后为透明状。经1%的琼脂糖凝胶电泳检测,DNA条带清晰且无降解现象,说明DNA的完整性好(图1)。经微量分光光度计检测,DNA浓度为130～560 ng/μL,A260/280比值为1.8～2.0,说明DNA的纯度高,可满足SSR-PCR反应要求。

图1　CTAB法提取绣球基因组DNA的电泳结果

2.2绣球SSR-PCR反应体系的建立与优化

2.2.1SSR-PCR反应正交设计方差分析根据正交设计L25(56)进行PCR反应,采用直观分析法对25个组合的扩增结果进行评分。根据每个组合3次重复的扩增结果进行独立评分,得分依次为:1、6、8、7、6、12、9、7、5、8、19、24、11、12、10、13、15、12、16、11、9、20、17、13、3;1、7、9、6、5、10、8、7、4、8、22、24、13、11、9、12、13、11、15、12、8、18、14、11、2;1、5、8、7、5、11、10、8、4、7、20、25、14、12、11、13、15、13、16、10、9、19、15、12、3。将3次重复的评分值取平均数,根据平均得分结果进行方差分析。

利用SPSS 17.0软件对直观分析的评分结果进行方差分析,结果表明,Mg2+对反应体系的影响最大,而引物对反应体系的影响最小,5个因素水平的变化对绣球SSR-PCR反应体系的影响从大到小依次为:Mg2+>Taq聚合酶>dNTPs>DNA模板>引物(表4)。不同重复之间的差异不显著,证明3个重复的评分结果有较强的一致性。

表4　绣球SSR-PCR反应体系正交设计方差分析

注:**.在0.01水平上差异显著。

Note:**.Significant difference at the 0.01 level.

2.2.2DNA模板用量对SSR-PCR反应体系的影响本试验对DNA模板用量设置了5个梯度水平(20,40,60,80,100 ng),结果表明，结果均值随着DNA模板用量的增加呈先升高后下降的趋势(图2)。当DNA模板用量为20 ng时,扩增条带较弱;DNA模板用量增至60～100 ng时,扩增条带亮度增强且数量相对增加。从节省模板用量方面考虑,选择60 ng作为DNA模板的适宜用量。

图2　DNA模板浓度与结果均值的关系

2.2.3Mg2+浓度对SSR-PCR反应体系的影响Mg2+是Taq聚合酶的激活剂,浓度过低会降低酶活性,而浓度过高会扩增出非特异性产物。从图3可以看出,随着Mg2+浓度的增加结果均值呈先升高后下降的趋势,并且各个浓度之间均达到差异明显水平。当Mg2+浓度为0.5 mmol/L时,扩增条带很弱;Mg2+浓度增加至1.5 mmol/L,扩增条带清晰且无非特异性条带;当Mg2+浓度大于1.5 mmol/L,扩增条带亮度无明显变化,但出现非特异性条带。因此,本研究选择1.5 mmol/L为绣球SSR-PCR反应体系中Mg2+浓度的最佳反应水平。

图3　Mg2+浓度与结果均值的关系

2.2.4dNTPs浓度对SSR-PCR反应体系的影响dNTPs是SSR-PCR反应体系的重要底物,其浓度的大小直接影响PCR扩增的效率。结果表明,结果均值随着dNTPs浓度的增加逐渐升高,在0.3 mmol/L时达到最大值,然后随着dNTPs浓度继续增加结果均值开始降低(图4)。因此,选择0.3mmol/L为SSR-PCR反应体系的最佳反应水平。

图4　dNTPs浓度与结果均值的关系

2.2.5引物浓度对SSR-PCR反应体系的影响引物浓度对SSR-PCR反应体系的影响如图5所示,结果均值随着引物浓度的增加呈升高的趋势。引物浓度为0.1～0.5 μmol/L时,均有扩增产物出现。当引物浓度为0.1 μmol/L时,由于引物浓度过低扩增条带较弱;随着引物浓度的增加,扩增产物的产量也逐渐增加。考虑到引物浓度过高,有可能产生引物二聚体和非特异性产物,确定0.4 μmol/L作为引物的最佳浓度,其扩增产物质量最好。

图5　引物浓度与结果均值的关系

2.2.6Taq聚合酶用量对SSR-PCR反应体系的影响Taq聚合酶是SSR-PCR反应体系中的重要因素之一。从图6可以看出,Taq聚合酶用量对SSR-PCR反应体系的影响仅次于Mg2+浓度,结果均值随着Taq聚合酶用量的增加呈先升高后降低的趋势,在0.8 U时达到最大值。当Taq聚合酶用量超过0.8 U时,结果均值呈逐渐降低的趋势,扩增条带出现弥散现象,且非特异性扩增条带增多(图6)。从扩增效率和节约经济方面综合考虑,确定0.8 U为Taq聚合酶最适用量。

图6　Taq聚合酶用量与结果均值的关系

2.3最佳SSR-PCR反应体系的验证

综合上述分析,优化后的绣球SSR-PCR反应体系如下:20 μL反应体系中Mg2+浓度为1.5 mmol/L,dNTPs浓度为0.3 mmol/L,引物浓度为0.4 μmol/L,DNA模板量为60 ng,Taq聚合酶量为0.8 U。反应程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,最佳温度退火40 s,72 ℃ 1 min,33个循环;72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。

以大花绣球品种史欧尼基因组DNA为模板,采用上述正交设计试验优化的绣球SSR-PCR反应体系对30对SSR引物进行筛选,从中筛选出了扩增条带清晰、稳定性好的16对引物。利用这16对引物对10个绣球品种基因组DNA进行PCR扩增,进一步验证上述反应体系的扩增效果。其中,引物HM-3、HM-7和HM-12的扩增结果电泳图谱中可检测到清晰明亮且具有多态性的条带(图7)。

图7　引物HM-3、HM-7和HM-12对10个绣球品种扩增的结果

3　讨论

近年来,在许多植物中关于SSR-PCR反应体系优化的研究已有很多,但在绣球中还未见相关报道。建立SSR-PCR反应体系是应用SSR标记技术的前提,但是不同植物的最佳反应体系会有所不同,建立适合绣球的SSR-PCR反应体系非常重要。目前,PCR反应体系进行优化主要采用单因素梯度试验法和正交设计试验。采用单因素梯度试验法优化PCR反应体系,需要进行多次梯度试验,这样不仅时间消耗长、试验成本高,而且不能准确地反映出各因素间的交互关系[12]。本试验采用的正交试验设计是一种快速、经济、高效的试验设计方法,利用规格化的正交表将各个试验因素、水平之间的组合进行均匀搭配,选择具有代表性的水平组合进行试验,得到最佳的水平组合,充分考虑了各试验因素的平均分配和交互作用[13]。

PCR反应是一个多因素控制的综合反应体系,容易受到DNA模板、Mg2+、dNTPs、引物、Taq聚合酶等因素的影响,其中每个因素都有可能会影响到扩增的效率、特异性及产量[14]。本研究首次利用正交设计对影响绣球PCR反应体系的5个主要因素进行优化试验,建立适合于绣球的SSR-PCR反应体系(20 μL):Mg2+浓度为1.5 mmol/L,dNTPs浓度为0.3 mmol/L,引物浓度为0.4 μmol/L,DNA模板量为60 ng,Taq聚合酶量为0.8 U,ddH2O补至20 μL。Mg2+浓度直接影响扩增的效率和特异性,适宜的Mg2+浓度对PCR反应非常重要[15]。本研究发现,Mg2+浓度对绣球PCR反应体系的影响最大,这一结果与向日葵[15]、梨[16]、紫叶酢浆草[17]等植物的研究结果相似。在本研究中,Taq聚合酶量对绣球PCR反应体系的影响仅次于Mg2+浓度,当用量高时会有非特异性扩增条带产生,并且增加试验成本。这一结果与药用菊花[18]、苦参[19]等植物的研究结果不同,认为Taq聚合酶对PCR反应的影响最大,分析这种差异可能与研究物种和不同因素水平设计有关。dNTPs浓度对绣球PCR反应也会有一定的影响,浓度低时会影响扩增的效率,而浓度高时会与Taq聚合酶竞争结合Mg2+进而降低酶活性。在本试验中,当dNTPs浓度为0.3 mmol/L时扩增结果最好,这与任鹏鸿等[20]对菊芋SSR-PCR反应体系优化的结果一致。本试验还发现引物浓度对绣球SSR-PCR反应的影响最小,在0.1～0.5 μmol/L的浓度内均有扩增产物出现,但引物浓度过高会产生引物二聚体和非特异性产物。

本试验利用建立的绣球SSR-PCR反应体系进行SSR引物筛选,从30对引物中筛选出了扩增条带清晰、重复性好的16对SSR引物,表明该体系具有较好的稳定性和重复性。利用这些引物对10个绣球品种的基因组DNA进行PCR扩增,其中3对引物的扩增条带清晰且具有多态性,进一步验证了该反应体系具有较好的通用性。因此,本研究建立和优化的绣球SSR-PCR反应体系,为SSR分子标记技术应用于绣球植物的种质资源鉴定、遗传多样性分析、遗传图谱构建、标记辅助育种等研究提供了理论依据和技术支持。

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Establishment and Optimization of SSR-PCR Reaction System inHydrangeamacrophylla

JIA Xinping,SUN Xiaobo,LIANG Lijian,DENG Yanming,SU Jiale,ZHOU Jiantao

(Institute of Horticulture,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement,Nanjing210014,China)

In order to establish and optimize the SSR-PCR reaction system ofHydrangeamacrophylla,and the orthogonal design L25(56)was applied to optimize the five main factors(Mg2+,dNTPs,primers,DNA template,andTaqenzyme)at five levels of SSR-PCR reaction system.The PCR result was analyzed to select the best levels of five factors and established the suitable SSR reaction system forHydrangeamacrophylla.The results showed that the optimal SSR-PCR system of 20 μL volumes consists of 60 ng DNA template,1.5 mmol/L Mg2+,0.3 mmol/L dNTPs,0.4 μmol/L primer,and 0.8 UTaqpolymerase.PCR amplification procedures were pre-denaturation for 5 min at 94 ℃;followed by 33 cycles of denaturation for 1 min at 94 ℃,annealing at a suitable for primers for 40 s,extension for 1 min at 72 ℃;and a final extension for 10 min at 72 ℃,then stored at 4 ℃.The optimal SSR-PCR reaction system was used to verify by 10 cultivars ofHydrangeamacrophylla,and the results showed that it was excellent stability and repeatability for the optimal reaction system.The establishment of this reaction system provides a theoretical basis and technical references for further research on the genusHydrangeaby SSR markers.

Hydrangeamacrophylla;SSR-PCR;Orthogonal design;Reaction system

2016-06-13

江苏省科技支撑计划项目(BE2014408)；江苏省农科院成果转化与推广项目(KF15(5005))

贾新平(1983-),男,山西晋城人,助理研究员,博士,主要从事观赏植物分子生物学研究。

周建涛(1965-),男,江苏武进人,研究员,博士,主要从事园艺及现代农业研究。

S68.03

A

1000-7091(2016)04-0068-06

10.7668/hbnxb.2016.04.012