口腔慢性移植物抗宿主病患者唾液T细胞相关细胞因子的表达水平

彭艳　雍翔智　冯豆豆　曾启新　梅国城　陶人川

1.广西医科大学附属口腔医院牙周黏膜科　南宁 530021；2.广西艾滋病防治研究重点实验室　南宁 530021

口腔慢性移植物抗宿主病患者唾液T细胞相关细胞因子的表达水平

彭艳1,2雍翔智1冯豆豆1,2曾启新1梅国城1陶人川1,2

1.广西医科大学附属口腔医院牙周黏膜科南宁 530021；2.广西艾滋病防治研究重点实验室南宁 530021

目的检测异基因造血干细胞移植后口腔慢性移植物抗宿主病（cGVHD）患者唾液T细胞相关细胞因子的表达水平，了解患者T细胞的免疫状态及其作用机制。方法移植组纳入确诊为口腔cGVHD患者18例，并对其口腔表征进行评分；对照组纳入健康者18例。收集两组唾液，采用流式液相多重蛋白定量技术检测T细胞相关细胞因子——干扰素（IFN）-γ、白细胞介素（IL）-4、IL-6、IL-10表达水平。结果移植组中IFN-γ，IL-4水平与对照组无统计学差异；移植组IL-6、IL-10表达量分别为255.04 pg·mL-1和1.49 pg·mL-1，显著高于对照组6.02 pg·mL-1和0.17 pg·mL-1，差异具有统计学意义（P＜0.01）；移植组中口腔表征评分与IL-6 、IL-10浓度均呈正相关关系，相关系数分别为r=0.978（P＜0.01）、r=0.668（P＜0.01），同时IL-6和IL-10浓度呈正相关关系，相关系数r=0.666 （P＜0.01）。结论口腔cGVHD患者唾液IL-6和IL-10表达呈上调趋势，口腔表征越严重，IL-6和IL-10表达水平越高，提示口腔cGVHD发病机制可能由Th2细胞相关细胞因子（IL-6、IL-10）介导。

造血干细胞移植；口腔慢性移植物抗宿主病；T细胞

This study was supported by the Natural Science Foundation of Guangxi（2014GXNSFAA118149）.

［Abstract］ObjectiveThis study aimed to explore the levels of T-cell cytokines in saliva of patients with oral chronic graft-versus-host-disease（cGVHD） who have undergone hematopoietic stem cell transplantation，as well as understand the T-cell immune status in patients. MethodsEighteen oral cGVHD patients were recruited as the transplantation group，and the scores of oral manifestations were recorded. Furthermore，18 healthy volunteers were selected as healthy controls. The unstimulated saliva of the two groups was collected，and the concentrations of T-cell cytokines such as interferon（IFN）-γ，interleukin（IL）-4，IL-6，and IL-10 in saliva were detected by cytometric bead array. ResultsIFN-γ and IL-4 levels in the transplantation group showed no difference from those of healthy controls. By contrast，the levels of IL-6 and IL-10 were significantly higher than those of healthy controls（255.04 pg·mL-1vs. 6.02 pg·mL-1and 1.49 pg·mL-1vs. 0.17 pg·mL-1，respectively；P＜0.01）. The scores of oral manifestations were positively related to IL-6（r=0.978，P＜0.01） and IL-10 （r=0.668，P＜0.01） levels. The levels of IL-6 and IL-10 were also positively correlated（r=0.666，P＜0.01）. ConclusionThe expression levels of IL-6 and IL-10 in saliva were both up-regulated in oral cGVHD patients. Severe oral manifestations corresponded to high levels of IL-6 and IL-10. Thus，Th2 cell cytokines（IL-6 andIL-10） might play a significant role in the pathogenesis of oral cGVHD.

［Key words］hematopoietic stem cell transplantation；oral chronic graft-versus-host-disease；T cell

异基因造血干细胞移植（hematopoietic stemcell transplantation，HSCT）是治疗血液系统恶性肿瘤的主要手段，其中慢性移植物抗宿主病（chronic graft-versus-host-disease，cGVHD）是常见的并发症。cGVHD被确认为是HSCT后，患者在无复发疾病影响的情况下高死亡率的原因及影响患者长期健康生存的重要因素［1-2］。

目前，cGVHD的发生机制尚不明确，大致有两种观点：一种理论认为cGVHD仅仅是一个晚期的异源性反应，即供者原始T淋巴细胞向辅助性T细胞（T helper cell，Th）2细胞分化，与B细胞活化和自身抗体的产生相关［3］；另一种观点则认为是HSCT后T细胞的重建缺陷，包括外周免疫耐受的改变和中枢负免疫应答减少，导致细胞因子分泌，溶细胞活动和抗体产生的改变［4］。

口腔是cGVHD 最常累及的器官之一，仅次于皮肤，移植后患者出现口腔cGVHD的范围为45%～83%，常见的靶组织为黏膜、唾液腺、牙周组织等［5］。唾液是距离病灶最近的体液，同时唾液的采集具有无创性，相较于血液，唾液更易获取。

本研究通过测定口腔cGVHD患者唾液T细胞相关细胞因子的表达水平，以初步了解口腔cGVHD患者T细胞免疫特点。

1　材料和方法

1.1研究对象

将2015年1—6月在广西医科大学附属口腔医院确诊［6］为口腔cGVHD的患者18例纳入移植组，其中男性10例，女性8例，平均年龄（28.72±8.93）岁，移植病程均为100～180 d。同期，将与移植组性别、年龄匹配的无全身及口腔疾病的健康者18例纳入对照组，其中男性9例，女性9例，平均年龄（33.47±7.99）岁。所有研究对象均知情同意。

1.2主要试剂和仪器

流式细胞仪、FCAP Array v1.0 CBA分析软件、流式液相多重蛋白定量技术（cytometric bead array，CBA）自由组合试剂（BD公司，美国）。

1.3方法

所有研究对象均于早上9：00—11：00就诊，根据2014年美国国立卫生研究院（national institutes of health，NIH）制定的诊断［6］及口腔表征评分标准［7］（表1）对口腔cGVHD患者进行评分。

表1　cGVHD患者口腔表征评分标准Tab1　Scoring criteria of oral manifestations among cGVHD patients

所有研究对象均采用50 mL离心管收集非刺激性全唾液，2 h内送往实验室，3 500 r·min-1常温下离心10 min，收集上清液分装，保存在-80 ℃备用。

批量检测，每个待测样本溶解后3 500 r·min-1常温下离心10 min，取上清液50 μL用于CBA检测IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10细胞因子。CBA检测在流式细胞仪上进行，具体步骤参照试剂盒说明，运用FCAP Array v1.0分析软件进行标准曲线绘制及数据分析。

1.4统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件对结果进行统计学处理。两组细胞因子浓度比较采用两样本均数比较的非参数检验，相关分析采用Spearman等级相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1基本资料及口腔表征

移植组与对照组年龄、性别比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。18例口腔cGVHD患者中口内检查均见口腔白纹，唇、双颊、舌、牙龈、上腭均可累及；其中11例有糜烂（红斑样病损），主要集中在双颊、硬腭，疼痛不适，影响进食；5例述有口干，唾液分泌量减少；3例罹患溃疡，舌边缘多见。口腔表征评分分布为1分5例，2分2例，3分2例，4分2例，5分1例，6分5例，9分1例。

2.2两组唾液IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10浓度比较

采用CBA技术测定移植组18份和对照组18份唾液样本中的IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10细胞因子浓度。经检验，细胞因子浓度均呈非正态分布，因此用中位数和四分位数间距描述，采用两独立样本均数比较的非参数检验。对两组唾液中的IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10浓度进行比较，IFN-γ和IL-4浓度无明显差异（P＞0.05）；而移植组中IL-6、IL-10浓度分别为255.04（1 904.49）pg·mL-1和1.49（3.29）pg·mL-1，显著高于对照组6.02 （8.56）pg·mL-1和0.17（2.20）pg·mL-1，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

2.3移植组患者口腔表征评分与唾液中IL-6、IL-10浓度相关性分析

对移植组患者口腔表征评分与唾液中IL-6、IL-10浓度做相关性分析，结果显示：口腔表征评分与唾液中IL-6、IL-10浓度均呈正相关关系，相关系数分别为r=0.978（P＜0.01）和r=0.668（P＜0.01）；唾液中IL-6和IL-10浓度也呈正相关关系，相关系数为r=0.666（P＜0.01）。

3　讨论

本研究中cGVHD患者的口腔表征基本为口腔白纹、糜烂、溃疡、口干等，与本课题组在前期研究中发现基本一致［8］。NIH最新发布的口腔cGVHD诊断标准［6］中，苔藓样改变即过角化白纹被视为特征性表现，病损可累及口腔内任何部位；红斑样病损多表现在硬腭与软腭；疱性病损多见于口腔后份黏膜，同时由于患者进食时易破溃而形成溃疡，从而影响患者的进食和生活质量。多数患者还会伴有疼痛，唾液分泌量减少，进而导致口腔干燥，同时伴随着唾液免疫球蛋白的减少而导致口腔易感性增高［9］。对口腔表征进行评分，其分值大小可以间接反映疾病的严重程度，同时也可根据口腔表征评分进行相应的临床用药。

移植物抗宿主病中，骨髓移植物中成熟T细胞被宿主的异型组织相容性抗原（包括主要与次要相容性抗原）激活，增殖分化为效应T细胞，并随血循环游走至受者全身，对宿主组织或器官发动免疫攻击［10］。Th1细胞主要分泌IFN-γ、IL-2等细胞因子，参与细胞免疫，IFN-γ可抑制Th2介导的体液免疫。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-6和IL-10，主要介导体液免疫，其中IL-4和IL-10可抑制细胞免疫应答。

Hayashida等［11］研究发现，Th1细胞因子如IL-2和INF-γ几乎表达在所有cGVHD口腔病损的患者，细胞因子表达的程度与淋巴细胞浸润程度或临床严重程度没有关系；相比之下，cGVHD口腔病变的患者Th2细胞因子如IL-4和IL-5表达与淋巴细胞浸润和严重的组织损伤有关；他们认为，Th1细胞因子可能在cGVHD初始阶段和/或维持阶段起作用，而Th2细胞因子则在疾病进展中起作用。Lin-hares等［12］则认为急性GVHD是Th1淋巴细胞介导的细胞免疫反应，而cGVHD是由Th2淋巴细胞介导的体液免疫反应。

IL-6是一种前炎症细胞因子，在移植后感染、黏膜炎、肝静脉闭塞症和GVHD等情况下，其水平都会升高。有研究［13］指出，IL-6是局部黏膜炎症反应中的重要中介物，可能会是一个潜在的反映活动性口腔cGVHD严重程度的生物标志物。IL-10是一种抗炎症因子，可以抑制INF-γ、IL-2等细胞因子分泌。IL-10水平升高可能原因是：当系统发生细胞因子风暴时，IL-10作为一种抗炎因子，反应性的增高以对抗炎症反应，于是IL-10的水平就和炎症反应的水平呈正相关关系。本研究中IL-6和IL-10在口腔cGVHD中高表达，并且与疾病严重程度成正相关关系，预示着口腔cGVHD可能是由Th2相关细胞介导。

常规的口腔cGVHD复查及口腔科与移植团队间的良好沟通，对于移植后患者并发症的预防以及治疗是非常重要的。细胞因子有着成为口腔cGVHD监测及早期预警的良好条件，因为细胞因子可以直接刺激并且活化效应细胞，展开对靶器官的攻击，是整个免疫激活过程的核心因素；同时细胞因子对检测要求低，采用CBA技术检测时，血清样本可在-80 ℃冻存3～6个月，技术稳定，可重复性好。

综上，本实验中口腔cGVHD患者唾液IL-6和IL-10表达呈上调趋势；口腔表征越严重，IL-6和IL-10表达水平越高，预示着IL-6和IL-10可以作为潜在性的预测生物因子对cGVHD进行预测，以起到早预防、早发现、早治疗的作用。

［1］Fraser CJ，Bhatia S，Ness K，et al. Impact of chronic graft-versus-host disease on the health status of hematopoietic cell transplantation survivors： a reportfrom the Bone Marrow Transplant Survivor Study［J］. Blood，2006，108（8）：2867-2873.

［2］Lee JW，Deeg HJ. Prevention of chronic GVHD［J］. Best Pract Res Clin Haematol，2008，21（2）：259-270.

［3］Kataoka Y，Iwasaki T，Kuroiwa T，et al. The role of donor T cells for target organ injuries in acute and chronic graft-versus-host disease［J］. Immunology，2001，103（3）：310-318.

［4］Blazar BR，Murphy WJ，Abedi M. Advances in graftversus-host disease biology and therapy［J］. Nat Rev Immunol，2012，12（6）：443-458.

［5］Margaix-Muñoz M，Bagán JV，Jiménez Y，et al. Graftversus-host disease affecting oral cavity. A review ［J］. J Clin Exp Dent，2015，7（1）：e138-e145.

［6］Jagasia MH，Greinix HT，Arora M，et al. National Institutes of Health consensus development project on criteria for clinical trials in chronic graft-versushost disease： Ⅰ. The 2014 diagnosis and staging working group report［J］. Biol Blood Marrow Transplant，2015，21（3）：389-401.

［7］Lee SJ，Wolff D，Kitko C，et al. Measuring therapeutic response in chronic graft-versus-host disease. National Institutes of Health consensus development project on criteria for clinical trials in chronic graftversus-host disease： Ⅳ. The 2014 Response Criteria Working Group report［J］. Biol Blood Marrow Transplant，2015，21（6）：984-999.

［8］肖丽婷，彭圆媛，陶人川，等. 广西地区异基因造血干细胞移植后患者口腔黏膜健康状况研究［J］. 口腔医学研究，2011，27（10）：881-885. Xiao LT，Peng YY，Tao RC，et al. Oral mucosa health status among patients after aiiogeneic hematopoietic stem cell transplantation in guangxi district［J］. J Oral Sci Res，2011，27（10）：881-885.

［9］Nagler RM，Nagler A. The molecular basis of salivary gland involvement in graft—vs.—host disease［J］. J Dent Res，2004，83（2）：98-103.

［10］龚非力. 医学免疫学［M］. 3版. 北京： 科学出版社，2009：278. Gong FL. Medical Immunology［M］. 3rd ed. Beijing：China Science Publishing，2009：278.

［11］Hayashida JN，Nakamura S，Toyoshima T，et al. Possible involvement of cytokines，chemokines and chemokine receptors in the initiation and progression of chronic GVHD［J］. Bone Marrow Transplant，2013，48（1）：115-123.

［12］Linhares YP，Pavletic S，Gale RP. Chronic GVHD：Where are we？ Where do we want to be？ Will immunomodulatory drugs help［J］. Bone Marrow Transplant，2013，48（2）：203-209.

［13］Fall-Dickson JM，Mitchell SA，Marden S，et al. Oral symptom intensity，health-related quality of life，and correlative salivary cytokines in adult survivors of hematopoietic stem cell transplantation with oral chronic graft-versus-host disease［J］. Biol Blood Marrow Transplant，2010，16（7）：948-956.

（本文编辑张玉楠）

Salivary T cell cytokine expression in oral chronic graft-versus-host-disease

Peng Yan1，2，Yong Xiangzhi1，Feng Doudou1，2，Zeng Qixin1，Mei Guocheng1，Tao Renchuan1，2.（1. Dept. of Periodontal Mucosa，Hospital of Stomatology，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China；2. Guangxi Key Laboratory of AIDS Prevention and Treatment，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China）

R 781.5

A

10.7518/gjkq.2016.05.008

2016-01-02；

2016-04-19

广西自然科学基金（2014GXNSFAA118149）

彭艳，硕士，Email：pengyan1229@126.com

陶人川，教授，博士，Email：dr.taorc@foxmail.com