宽体金线蛭油酸的气相色谱指纹图谱

黄勇，左智力，杨益林，张月云，韦范，赵成坚，缪剑华

（1.广西壮族自治区药用植物园，广西南宁　530023；2.成都动物园，四川成都　610081；3.广西壮族自治区分析测试研究中心，广西南宁　530022）

·中药质量与控制·

宽体金线蛭油酸的气相色谱指纹图谱

黄勇1，左智力2，杨益林3，张月云1，韦范1，赵成坚1，缪剑华1

（1.广西壮族自治区药用植物园，广西南宁530023；2.成都动物园，四川成都610081；3.广西壮族自治区分析测试研究中心，广西南宁530022）

【目的】建立宽体金线蛭油酸的气相色谱指纹图谱。【方法】以不同来源地和不同规格的共10批宽体金线蛭为研究对象，选择Agilent 6890N型气相色谱仪，DB-WAX色谱柱 （30 mm×0.32 mm×0.25 μm），气化温度为270℃，柱温130℃，检测器（FID）温度为280℃。采用中国药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》进行相似度计算。【结果】不同规格的宽体金线蛭油酸含量差异有统计学意义（F2，7=7.350，P=0.019），清水晒干品分别和矾品、饮片/晒干的油酸含量比较差异有统计学意义（P=0.021，P=0.009）。指纹图谱的相似度在0.458～0.998之间，其中与其他样品和对照指纹图谱的相似度比较，来源于广西荔浦的样品相似度为最低。【结论】大部分样品指纹图谱的相似度非常高，所建立的气相色谱指纹图谱可有效鉴别宽体金线蛭的优劣品，该方法可为宽体金线蛭的日常质量控制提供一定参考。

水蛭；气相色谱；指纹图谱

水蛭俗称为蚂蝗，其基源是水蛭科动物日本医蛭（Hirudo nipponica Whitman）、宽体金线蛭（Whitmania pigra Whitman）或柳叶蚂蝗（Whitmania acranulata Whitman）的干燥全体。水蛭在中国药典（2015）中有收录［1］，其中宽体金线蛭是国内中药材市场上的主要销售商品，其味苦咸腥、性平，有小毒，具有破血、逐瘀、通经等效用，被广泛应用于临床治疗。宽体金线蛭分布广泛，传统上用药是以野生捕捉为主。宽体金线蛭的人工养殖已开展，规模逐年增大。然而，不同养殖地的水蛭药材质量差异较大，其临床疗效可能受到严重影响［2］。吸血蛭类如日本医蛭含有重要的抗凝物质水蛭素，而非吸血蛭类如靠吸吮螺体等动物体液生存的宽体金线蛭不含水蛭素，但具有抗凝、抗血栓等作用［3-7］。目前有关宽体金线蛭的有效药用成分研究报道比较少［7］。吕丹等［8］分析了山东微山湖宽体金线蛭的生化成分，认为脂肪酸和氨基酸的独特组成可能是其高药用价值的重要依据之一。

油酸属于单不饱和脂肪酸，对血液总胆固醇和有害胆固醇具有明显的降低作用，却不降低有益胆固醇，因此在预防心血管疾病方面发挥有效作用［9-10］。宽体金线蛭中油酸（18∶1）的含量在脂肪酸中的含量次高［8］。因此，本研究对全国不同产地或中药材市场的宽体金线蛭油酸的气相色谱指纹图谱进行分析，以期为宽体金线蛭的人工养殖和药材质量评价体系的建立等提供参考，现报道如下。

1　材料与方法

1.1材料试验用宽体金线蛭采自全国各地养殖地或者中药材市场，采集样品信息见表1。经江苏盐城工学院刘飞博士鉴定为黄蛭科金线蛭属Whitmaniapigra样品。

表1　宽体金线蛭样品收集和油酸含量Table 1　Oleic acid content of Whitmania pigra samples from different sources

1.2仪器与试剂Agilent 6890N型气相色谱仪［带氢火焰离子检测器（FID）］（美国Agilent公司）；甲醇（色谱纯，德国CNW Technologies公司，批号：40033024000）；正庚烷（色谱纯，天津市光复精细化工研究所，批号：2014041301）；三氟化硼（色谱纯，中国阿拉丁公司，批号：B104431）；乙腈（分析纯，成都市科龙化工试剂厂，批号：2014102201）；氯化钠（分析纯，西陇化工股份有限公司，批号：141111）。

1.3色谱条件色谱分析柱：DB-WAX（30 mm× 0.32 mm×0.25 μm）；载气为氮气40 kPa，氢气为30 kPa，空气为400 kPa；气化室温度为270℃；检测器（FID）温度为 280℃，升温程序：柱温130℃，保持5 min，以3℃/min速率升至230℃，保持10 min。

1.4对照品溶液制备自制现榨花生油提取油酸成分作为对照品。取600 mg加体积分数15%三氟化硼甲醇溶液甲脂化，30 mL正庚烷萃取，取1 μL溶液注入气相色谱仪，测定并记录色谱图，采样时间40 min。对照品图谱见图1。

图1　对照品气相色谱指纹图谱Figure 1　Gas chromatographic fingerprints of the control of oleic acid

1.5供试品溶液制备称取干样品5.0 g，按GB/ T22223-2008处理脂肪，加三氟化硼溶液脂化，30 mL正庚烷萃取，取1 μL溶液上机，注入气相色谱仪，测定并记录色谱图，采样时间为40 min。

1.6方法学考察

1.6.1稳定性实验取样品编号为S2供试品溶液，分别在0、4、8、12、24、36、48 h不同时间点进行检测，计算相对保留时间和相对峰面积，结果表明各峰相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差（sR）分别低于4.1%。

1.6.2精密度实验取样品编号为S9供试品溶液，连续进样5次，计算相对保留时间和相对峰面积，结果表明各峰相对保留时间和相对峰面积的sR均低于4.5%。

1.6.3重复性试验取样品编号为S10供试品溶液，同法检测，计算相对保留时间和相对峰面积，结果表明各峰相对保留时间和相对峰的sR均低于5.0%，表明其重复性良好。

1.7数据处理

1.7.1统计方法为了探讨不同规格的样品间的油酸含量的差异，本研究采用单因素方差进行统计分析，所用统计软件为SPSS 19.0。

1.7.2相似度计算本研究采用中国药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》软件计算10批宽体金线蛭样品的指纹图谱与它们对照图谱（对照图谱的建立采用中位数法）的相似度。

2　结果

2.1宽体金线蛭的油酸含量特点从表1可见，油酸含量最高的是湖北恩威的清水晒干品，为0.84 mg/g，而最低的是广西荔浦药材市场的干品，仅0.12 mg/g。不同规格间的宽体金线蛭的油酸含量差异有统计学意义（F2，7=7.350，P=0.019），其中规格为矾品和饮片/晒干的油酸含量差异无统计学意义（P=0.924），规格为清水晒干品分别与矾品、饮片/晒干的油酸含量比较，差异有统计学意义（P=0.021，P=0.009）。

2.2色谱图及共有峰的标定用建立的色谱条件，对10批样品进行测定，得到宽体金线蛭油酸指纹图谱（见图2）。对上述油酸色谱图谱进行归属，并生成对照用特征图谱（见图3）。

比较分析10批样品的色谱图，以图1作为参照谱，进行自动匹配［11］。通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》软件生成一个10批药材的中位值的图谱作为对照用特征图谱，以此作为药材的对照用特征图谱（见图3）。其中以保留时间为16.461 min的色谱峰被指定为基准峰，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积（见表2）。相对保留时间的sR值为0.03%～0.28%，但相对峰面积差别很大，sR值为4.25%～45.50%。

图2　10批宽体金线蛭油酸气相色谱指纹图谱重叠图Figure 2　Gas chromatographic fingerprints of ten batches of Whitmania pigra samples

图3　宽体金线蛭油酸气相对照色谱指纹图谱Figure 3　Gas chromatographic contrast fingerprint of Whitmania pigra

表2　10批样品的保留时间和峰面积Table 2　Results of retention time and common peaks of ten batches of the samples　sR/%

2.3相似度计算利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》，对10批样品指纹图谱进行自动匹配，相似度计算结果在0.458～0.998之间（见表3）。其中，8号样品与对照指纹图谱的相似度为0.458，低于其他样品与对照指纹图谱的相似度。可见10批样品中除了8号和10号样品外，其他样品指纹图谱相似度高。

表3　10批宽体金线蛭油酸相似度计算结果Table 3　Similarity of ten batches of Whitmania pigra samples

3　讨论

从指纹图谱中可以看出，不同来源地的10批宽体金线蛭油酸气相色谱指纹图谱中虽然出现了相应的色谱峰，但是峰面积比值有所不同，这表明不同来源地之间因成分相对含量不同所表现出的质量水平也不同。这也可以从不同规格的油酸含量呈显著性差异得到证实。油酸含量的高低可能除了与宽体金线蛭的生活环境有关，还可能跟炮制方法不同有关系。鲜品宽体金线蛭中的油酸含量最高，原因可能是矾品、长期放置、高温烫死等处理会导致油酸容易挥发。因此，中药制剂中需要注意原药材产地的来源，并确保提取工艺技术相同，才可能保证中药制剂质量的稳定可控。

10批样品的指纹图谱分析结果可以看出色谱峰的保留时间匹配较好，sR均小于0.28%，符合指纹图谱研究技术要求。从峰的匹配结果来看，主要色谱峰均能找到，然而共有峰的相对峰面积sR值间差异很大，表明不同来源的宽体金线蛭的共有成分含量悬殊，这可能与养殖方法、养殖环境、炮制方法有关［12］。

不同批次的指纹图谱相似度高，表明不同来源地的水蛭含有化学成分基本一致。然而，与其他样品和对照指纹图谱相似度比较，来源于广西荔浦的样品（8号）的相似度为最低（0.458），这可能是由于其油酸的含量（0.12 mg/g）为最低而导致。因此，从某种程度上来说，这表明了本研究所建立的色谱指纹图谱条件能够有效地区分宽体金线蛭的优劣品，可作为日常质量控制的方法，为制定标准提供一定的参考。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京：中国医药科技出版社，2015.

［2］鄢丹，李果.反相高效液相色谱法直接测定水蛭中14种未衍生氨基酸的含量［J］.分析化学，2006，34（5）：705.

［3］张汉贞，聂诗明，张丽萍，等.不同食性的水蛭抗凝血酶活性的比较［J］.中药材，1998，21（12）：599.

［4］刘君.蚂蝗抗凝血的活性成分研究［D］.辽宁中医学院博士学位论文，2005.

［5］刘君，杨松松，栾淑华.对不同食性的水蛭药效价值的探讨［J］.中医药学刊，2005，23（4）：705.

［6］杨潼.蚂蟥的医药学意义［J］.生物学通报，1996，31（3）：46.

［7］马洪利，韩宏岩，裴超俊，等.宽体金线蛭抗凝物质的提取与纯化［J］.安徽农业大学，2011，39（3）：14152.

［8］吕丹，黄旭雄，孙岳松，等.微山湖产宽体金线蛭生化组成的分析［J］.大连海洋大学学报，2011，26（3）：281.

［9］王娜.单不饱和脂肪酸对心血管疾病的作用机制［J］.中国实用医药，2010，23（5）：256.

［10］吴时敏.功能性油脂［M］.北京：中国轻工业出版社，2001.

［11］李晓蒙，肖佳尚.斑蝥药材气相色谱特征图谱研究［J］.中国医院药学杂志，2010，30（2）：116.

［12］徐佳，杨瑶珺，刘晓帆，等.水蛭的高效液相指纹图谱研究［J］.环球中医药，2013，6（8）：596.

【责任编辑：黄玲】

Gas Chromatographic Fingerprint of Oleic Acid of Whitmania pigra Whitman

HUANG Yong1，ZUO Zhili2，YANG Yilin3，ZHANG Yueyun1，WEI Fan1，ZHAO Chengjian1，MIAO Jianhua1
（1.Medicinal Plants Botanical Garden of the Guangxi Zhuang Autonomous Region，Nanning 530023 Guangxi，China；2.Chengdu Zoo，Chengdu 610081 Sichuan，China；3.Analytical and Testing Center of the Guangxi Zhuang
Autonomous Region，Nanning 530022 Guangxi，China）

ObjectiveTo establish the gas chromatographic（GC）fingerprint of oleic acid of Whitmania pigra Whitman for its quality control.Methods Ten batches of Whitmania pigra from different sources and processed by different methods were analyzed with Agilent 6890N gas chromatography detector on DB-WAX（30 mm×0.32 mm×0.25 μm）column at the vaporizing temperature of 270℃，column temperature of 130℃and flame ionization detector（FID）temperature of 280℃.We used a software of Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM（Version of 2004A）published by Chinese Pharmacopoeia Commission to calculate GC similarity.Results Oleic acid content of Whitmania pigra processed by different methods had significant differences（F2，7=7.350，P=0.019）.The oleic acid content of samples dried after washing with clean water significantly differed from that of the samples processed by alumen or the slices dried naturally（P=0.021，P =0.009）.The similarity of the fingerprints was in the range of 0.458-0.998.The similarity of samples from Lipu of Guangxi Province was the lowest.Conclusion The fingerprints of most of the samples have very high similarity.The established GC fingerprints can be used to effectively identify the qualified or inferior Whitmania pigra products，which will provide some reference for the quality control of Whitmania pigra.

Hirudo；gas chromatography；fingerprints

R284.1

A

1007-3213（2016）05-0716-04

10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．05．022

2016-01-14

黄勇（1982-），男，博士研究生，副研究员；E-mail:huangykiz@163.com

缪剑华（1962-），男，博士研究生，研究员；E-mail:mjh1962@vip.163.com

现代中药高技术产业发展专项（编号:发改办高技［2011］51号）；广西卫生和计划生育委员会中医药科技专项（编号:GZMZ1215）；南宁市科学研究与技术开发计划（编号:20162102）