苦参碱对K-ras基因突变型结肠癌细胞株增殖的抑制作用及机制研究

邹瞭南，莫德龙，陈国滨，刁德昌，何耀彬，朱伟

（广东省中医院胃肠外科，广东广州　510120）

苦参碱对K-ras基因突变型结肠癌细胞株增殖的抑制作用及机制研究

邹瞭南，莫德龙，陈国滨，刁德昌，何耀彬，朱伟

（广东省中医院胃肠外科，广东广州510120）

【目的】观察苦参碱对K-ras基因突变型结肠癌SW480细胞增殖的抑制作用及机制。【方法】以不同浓度苦参碱干预K-ras基因突变型人结肠癌SW480细胞，采用新型四唑氮盐（MTS）做比色分析测定细胞增殖，流式细胞技术（FCM）检测细胞凋亡，细胞划痕法观察细胞侵袭转移能力的变化，Western blotting方法检测细胞内丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路下游关键激酶MEK1/2蛋白的表达。【结果】与空白对照组比较，0.125~1 mg/mL浓度的苦参碱能显著抑制SW480细胞增殖，促进细胞凋亡，有效抑制结肠癌细胞的移行，降低MEK1/2蛋白的表达（P＜0.05），其作用强度随药物浓度增加有升高的趋势。【结论】苦参碱可能通过下调MAPK信号通路下游MEK1/2蛋白的表达，有效抑制SW480细胞的增殖和移行，并促进其凋亡。

苦参碱/药理学；结肠癌/中药疗法；蛋白表达；K-ras；MEK1/2；细胞培养

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是目前世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。在我国，随着人民生活水平的不断提高和饮食习惯的改变，CRC的发病率也在逐年升高，每年新发病例超过25万，已跃居第3～5位［1-2］。CRC的发生、发展涉及多基因、多信号转导通路的异常，包括癌基因的激活（如K-ras、c-src等），抑癌基因的表达缺失（如APC、p53、DCC等）和DNA错配修复基因表达缺陷［3］等。研究［4］发现，K-ras基因作为人体细胞内编码信号传导蛋白的原癌基因之一，编码由189个氨基酸组成的ras蛋白，它的异常在多种肿瘤的发生发展中起重要作用，其中又以在结直肠癌和胰腺癌中最为常见。在直肠癌的分子靶向治疗中表皮生长因子受体（EGFR）拮抗剂西妥昔单抗和帕尼单抗取得了巨大的成功，并成为美国国立综合癌症网络（NCCN）指南推荐治疗进展期结直肠癌的一线药物［5］。但随着研究的深入，发现当K-ras基因呈突变状态时，Ras蛋白持续活化，即使阻断上游EGFR也无法抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的活化，K-ras基因突变患者不能从西妥昔单抗和帕尼单抗的治疗中获益［6］。因此从Ras通路下游寻找新的化疗靶点，是治疗K-ras基因突变型结直肠癌的重要方法。

苦参碱是中药豆科植物苦参中提取的主要有效药物成分，具有广谱抗肿瘤作用，对胃癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、白血病和鼻咽癌等多种恶性肿瘤均有抑制作用［7］，但其对K-ras基因突变型结直肠癌的抑制作用及机制尚未见报道。本研究采用新型四唑氮盐（MTS）法、流式细胞技术（FCM）、细胞划痕法观察苦参碱对K-ras基因突变型结直肠癌SW480细胞的抑制作用，通过Western blotting方法观察苦参碱对SW480细胞内MAPK通路下游关键激酶MEK1/2蛋白表达的影响，以探求苦参碱治疗K-ras基因突变型CRC的可能机制，现将结果报道如下。

1　材料与方法

1.1细胞株K-ras基因突变型人结肠癌SW480细胞株，购自广州铭善上生物科技有限公司。

1.2实验药物苦参碱（批号：M109803）购自上海阿拉丁公司。苦参碱标准品的配制：精密称取100 mg苦参碱溶于100 μL二甲基亚砜（DMSO）中，混匀，即制备成1 mg/μL母液，4℃储存备用。临用时，用完全培养基稀释至实验浓度即可。

1.3主要试剂与仪器胎牛血清（批号：SH20087）、RPMI-1640培养基（批号：SH20809）、青链霉素（批号：SH20010）、磷酸盐缓冲液（PBS，批号：SH30256）（海克隆生物化学制品北京有限公司）；2.5 g/L trypsin-EDTA溶液（批号：T1300，北京索莱宝科技有限公司）；cellTiter96AQ单溶液细胞增殖检测试剂盒（MTS）（批号：G3582，北京普洛麦格生物技术有限公司）；异硫氰酸荧光素（Annexin VFITC）细胞凋亡检测试剂盒（批号：KAG106，江苏凯基生物技术股份有限公司）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的GAPDH优质内参（批号：KC-5G5，上海康成生物有限公司）；丝裂原活化蛋白激酶1抗体Anti-MEK1+MEK2（批号：ab178876，英国艾博抗公司）；过氧化物酶标记兔抗小鼠IgG（批号：6170-05，美国艾美捷公司）；过氧化物酶标记兔抗山羊IgG、兔抗大鼠IgG（武汉博士德生物工程有限公司）；发光液（批号：WBKLS0500）、PVDF膜（批号：IPVH00010）（密理博中国有限公司）。SWCJ-IF洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；SC3614低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；CKX41 U-CTR30-2倒置光学显微镜（日本Olympus公司）；HERACELL150细胞恒温培养箱、multiscan MK3酶标仪（美国Thermo公司）；BD calibur流式细胞仪（美国BD公司）。

1.4细胞培养与实验分组K-ras基因突变型人结肠癌SW480细胞株用含体积分数10%胎牛血清、0.01 g/L青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基培养，培养条件为：5%CO2、饱和湿度、37℃。实验分组：①空白对照组，②DMSO溶媒对照组（体积分数0.1%），③苦参碱0.125 mg/mL组，④苦参碱0.25 mg/mL组，⑤苦参碱0.5 mg/mL组，⑥苦参碱1 mg/mL组，共6组。

1.5MTS法检测细胞增殖将SW480细胞浓度调整为1×105个/mL接种到96孔板中，每孔细胞悬液100 μL，细胞贴壁后，苦参碱组给予终质量浓度为0.125、0.25、0.5、1 mg/mL。药物分别干预0、24、48、72 h，加入10 μL的MTS试剂，孵育4 h后，用酶标仪读取各孔波长为490 nm的光密度值（D），并根据D值计算出不同浓度苦参碱的半数抑制率（IC50）。

1.6形态学观察将SW480细胞浓度调整为1×106个/mL接种到6孔板中，细胞贴壁后，以1 mg/mL苦参碱干预24 h，于倒置光学显微镜下观察，拍照。1.7FCM法检测细胞凋亡SW480细胞调整密度接种于6孔培养板，细胞贴壁后，按照实验分组给予不同浓度的苦参碱刺激。干预24 h后，胰酶消化收集细胞，PBS洗2次，0.5 mL PBS重悬细胞于离心管中，加入1.25 μL Annexin V-FITC，室温避光反应15 min。1 000 r/min离心5 min，弃去上清，用预冷的PBS缓冲液0.5 mL重悬细胞，加入10 μL碘化丙啶（PI）后，立即采用流式细胞仪检测，CellQuest软件进行分析。

1.8细胞迁移实验在6孔板后用marker笔均匀划横线，间隔0.5～1 cm/道。每孔至少穿过5条线。在6孔板中加入浓度为10 μg/mL的纤维连接蛋白（FN）50 μL，置于4℃冰箱过夜。将处于对数生长期细胞制成悬液，细胞密度为1×106/mL均匀接种于6孔培养板中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。倒置光学显微镜下观察细胞长成单层后，细胞各组处理后换液，用丝裂霉素处理1 h，抑制细胞的分裂。用10 μL无菌微量移液枪头在细胞板上划痕，PBS液冲洗2～3次后，对照组用无血清RMPI-1640培养基培养，实验组分别用含药的无血清RMPI-1640培养基进行干预，于37℃、5% CO2培养箱中继续培养，分别于划痕后0、6、24、48 h取样，拍照，观察划痕愈合情况。采用Image Pro-Plus 6.0软件测量各组细胞相同时间点任意8个部位划痕宽度，计算细胞迁移距离迁移率：p移行距离迁移/（%）=（l0 h-l其他时间点）/l0 h×100%，以反映各组细胞运动迁移能力。

1.9Western blotting法检测蛋白表达按照实验分组给予不同浓度的药物刺激，干预24 h后，胰酶消化收集细胞，根据细胞量加入相应的蛋白裂解液，提取细胞总蛋白。将各组提取到蛋白的缓冲液分别转移到EP管中，在14 000 r/min转速下离心15 min，将上清液转移到新的EP管中。二喹啉甲酸（BCA）法检测蛋白含量，样品蛋白上样量为40 μg，将提取好样品的蛋白溶液和上样缓冲液按2∶1混合，100℃变性5 min，4℃备用。制备10%分离胶和8%浓缩胶，上样电泳，400 mA转膜100 min，0.5 g/L脱脂奶粉溶液室温封闭1 h，TBST液洗膜3次，每次5 min。一抗37℃下孵育2 h，TBST液洗膜3次后二抗室温孵育1 h。TBST洗膜3次，每次5 min，再用蒸馏水洗膜，每次2 min，共3次。将杂交膜取出，放置在透明塑料板上，将化学荧光发光底物均匀地滴加到杂交膜的表面，反应5 min。使用滤纸吸去转印膜表面多余发光底物溶液，将转印膜放至暗盒显影。

1.10统计方法采用SPSS 17.0软件进行数据处理，计量数据资料采用均数 ±标准差（±s）表示，2组数据之间采用t检验分析，多组数据采用方差分析，两两比较采用LSD法，非正态分布或方差不齐时采用秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1苦参碱对SW480细胞株的增殖抑制作用表1结果显示：0.125～1 mg/mL苦参碱处理结肠癌SW480细胞24、48、72 h后，各浓度组光密度值与相同时点空白对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），表明不同浓度的苦参碱能抑制结肠癌SW480细胞增殖，并且在0.125～1 mg/mL浓度范围内，随着药物浓度的增加，增殖抑制效应增强。IC50是衡量抗肿瘤药物抑制肿瘤生长能力的一个重要指标，IC50越大表明药物抑制能力越小，IC50越小表明药物抑制能力越大。苦参碱处理结肠癌SW480细胞株24、48、72 h后的IC50值分别为0.66、0.59、0.45 mg/mL，表明苦参碱连续干预结肠癌细胞时其抑制作用会逐渐增强，出现时间累积效应。由此可见，苦参碱对结肠癌SW480细胞株的增殖起到较好的抑制作用，并且具有浓度和时间依赖性。另外，由于24 h后苦参碱的抑制作用开始显现出来，故后续细胞凋亡研究和蛋白研究均选择该时间点作为苦参碱作用机制研究的一个切入点。

表1　各组在不同时间点的光密度值Table 1　Comparison of the optical density in various groups at different time points　（±s，D）

表1　各组在不同时间点的光密度值Table 1　Comparison of the optical density in various groups at different time points　（±s，D）

①P＜0.05，与空白对照组比较；②P＜0.05，与同组0 h比较

组别空白对照组DMSO组苦参碱0.125mg/mL组苦参碱0.25mg/mL组苦参碱0.5mg/mL组苦参碱1mg/mL组N 3 3 3 3 3 3 t=0h 0.51±0.00 0.51±0.00 0.51±0.00 0.51±0.01 0.50±0.01 0.51±0.01 t=24h 0.85±0.01 0.84±0.01 0.71±0.01①0.64±0.01①0.51±0.01①0.32±0.01①②t=48h 1.41±0.01 1.41±0.00 1.27±0.01①1.10±0.01①0.85±0.02①0.43±0.01①②t=72h 1.64±0.01 1.63±0.01 1.47±0.02①1.13±0.01①0.82±0.01①0.34±0.01①②

2.2苦参碱对细胞形态学的影响倒置光学显微镜结果显示：空白对照组的SW480细胞排列紧密、生长旺盛，贴壁生长（见图1a）；选取1 mg/mL苦参碱处理SW480细胞24 h，其细胞数目较对照组显著减少，细胞缩小、变圆，细胞增殖缓慢，细胞间连接疏松，细胞内颗粒物质明显增多，细胞透光性显著下降，部分细胞脱壁生长（见图1b）。

图1　1mg/mL苦参碱对SW480细胞的形态学影响（×10）Figure 1　The effect of matrine at 1 mg/mL on the morphology of SW480 cells（×10）

2.3苦参碱对SW480细胞株凋亡的影响表2、图2结果显示：与空白对照组比较，0.125～1 mg/mL苦参碱作用于SW480细胞24 h后，随着苦参碱浓度的增加，正常细胞比例逐渐下降，处于凋亡期细胞比例不断上升，表明苦参碱能促进K-ras基因突变型人结肠癌SW480细胞凋亡，并呈剂量依赖性。低浓度苦参碱以促进细胞进入凋亡晚期作用为主，随着浓度的增加，晚期凋亡细胞比例逐渐下降，早期凋亡细胞比例逐渐上升，高浓度苦参碱以促进细胞进入凋亡早期作用为主。

表2　各组SW480细胞早晚期凋亡比例Table 2　Comparison of the proportion of early-stage and late-stage apoptotic SW480 cells in various groups　［（±s），p/%］

表2　各组SW480细胞早晚期凋亡比例Table 2　Comparison of the proportion of early-stage and late-stage apoptotic SW480 cells in various groups　［（±s），p/%］

①P＜0.05，与空白对照组比较

组别空白对照组DMSO组苦参碱0.125 mg/mL组苦参碱0.25 mg/mL组苦参碱0.5 mg/mL组苦参碱1 mg/mL组N 3 3 3 3 3 3坏死细胞0.42±0.03 1.15±0.06 1.02±0.34①1.43±0.04①1.63±0.10①2.22±0.07①晚期凋亡细胞1.31±0.16 2.90±0.13 3.73±0.09①3.53±0.13①2.38±0.02①2.05±0.18①正常细胞97.21±0.13 95.47±0.16 94.17±0.13①93.93±0.28①90.84±0.20①87.00±0.43①早期凋亡细胞1.05±0.12 0.48±0.08 0.33±0.06①0.87±0.03①5.15±0.11①7.73±0.29①总凋亡细胞3.38±0.10 3.38±0.10 4.06±0.10①4.40±0.13①7.54±0.12①10.78±0.45①

2.4苦参碱对SW480细胞移行能力的影响表3结果显示：苦参碱处理SW480细胞12 h后，0.5 mg/mL、1 mg/mL浓度组细胞移行距离小于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），移行率均为2%。于24 h，各浓度苦参碱组移行距离明显小于空白对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。在0～48 h时间范围内，各浓度实验组迁移率随时间增加而增大，但在同一时间点，浓度越大，迁移率越小。

图2　各组流式细胞术检测结果Figure 2　The results of flow cytometry in various groups

表3　各组细胞的划痕试验移行距离测量结果Table 3　The migration distance results of the scratch test in various groups　l移行距离/μm

图3结果显示：倒置光学显微镜下见苦参碱处理SW480细胞48 h后，各浓度组细胞移行距离变化均呈现移行抑制效应，并且随着浓度升高，抑制效应加强。

2.5苦参碱对人结直肠癌SW480细胞MEK1/2蛋白表达水平的影响应用Quantity one软件分析各组条带灰度值，计算MEK1/2与GAPDH灰度值比，得到MEK1/2的相对表达量。表4、图4结果显示：与空白对照组比较，苦参碱干预人结直肠癌SW480细胞24 h后，0.125 mg/mL组的MEK1/2表达，差异无统计学意义（P＞0.05）；浓度为0.25 mg/mL、0.5 mg/mL及1 mg/mL苦参碱组的MEK1/2蛋白表达下降，差异有统计学意义（P＜0.05），其作用强度随浓度增加有升高的趋势。

3　讨论

筛选抗肿瘤药物的一个重要指标是抑制肿瘤的增殖［8］。MTS是一种新合成的四唑类化合物，能被活细胞线粒体内多种脱氢酶还原成有色的甲瓒产物，其颜色的深浅与某些敏感细胞活细胞数高度相关。相对四甲基偶氮唑盐（MTT）法而言，MTS法对细胞伤害较小，常用于药物对肿瘤的药敏试验。本研究MTS检测结果显示：苦参碱对K-ras基因突变型结肠癌细胞的增殖有直接抑制作用，并且该作用表现出明显的药物浓度依赖性和时间依赖性，与刘璐等［9］的研究结果相符。

图3　各组细胞的划痕试验结果（×10）Figure 3　The scratch test results in various groups（×10）

表4　各组细胞中的MEK1/2蛋白的相对表达量Table 4　The relative expression of MEK1/2 protein in various groups　（±s）

表4　各组细胞中的MEK1/2蛋白的相对表达量Table 4　The relative expression of MEK1/2 protein in various groups　（±s）

①P＜0.05，与空白对照组比较

组别空白对照组DMSO组苦参碱0.125 mg/mL组苦参碱0.25 mg/mL组苦参碱0.5mg/mL组苦参碱1 mg/mL组N 3 3 3 3 3 3相对表达量0.68±0.01 0.64±0.03 0.64±0.04 0.55±0.01①0.55±0.01①0.23±0.01①

图4　各组细胞中MEK1/2蛋白表达的凝胶电泳图Figure 4　The gel electrophoresis results of MEK1/2 protein expression in various groups

衡量抗肿瘤药物抗肿瘤能力的另一个重要指标是诱导肿瘤细胞凋亡能力的大小。形态学观察及Annexin V-FITC/PI染色法是目前检测细胞凋亡常用方法。凋亡细胞在形态学上会发生特征性的改变，早期凋亡细胞出现细胞质浓缩、细胞体积缩小，进而出现细胞核固缩、碎裂，出现凋亡小体［10］。本研究中光镜下观察到苦参碱作用于K-ras基因突变型结肠癌SW480细胞24 h后，细胞表现出典型的凋亡特征性改变。Annexin V-FITC/PI染色法检测结果显示：0.125～1 mg/mL苦参碱能诱导人结直肠癌SW480细胞凋亡，较低浓度时，苦参碱以促进细胞进入凋亡晚期作用为主，随着浓度升高，苦参碱则以促进肿瘤细胞进入凋亡早期为主。

侵袭和转移是肿瘤的基本生物学行为，研究其规律和发生机制对肿瘤的防治有重要意义。细胞划痕法是测定肿瘤细胞的运动特性的方法之一，其借鉴体外细胞致伤愈合实验模型，在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后加入药物观察其抑制肿瘤细胞迁移的能力。本研究的细胞划痕试验结果显示：苦参碱能抑制K-ras基因突变型结肠癌细胞的移行，并且随着药物浓度升高，抑制效应增强。

探讨结直肠癌发生发展的分子机制，开发结肠癌的靶向治疗药物已成为近年来研究的热点。结直肠癌发生的经典模式是正常结直肠上皮发展成腺瘤性息肉、息肉恶变、浸润性癌的过程，其中涉及多基因、多信号转导通路的异常［11-12］。目前尚未见一种基因突变或信号系统异常在所有类型结直肠癌中均出现的报道，没有一种基因突变或信号系统异常是结直肠癌发生发展过程中所必须的，但K-ras基因突变是结直肠癌发生早期的分子事件［13］。结肠癌中，K-ras基因的突变率约为40.4%［14］，并在结肠癌发生发展过程中，K-ras基因突变率随着肿瘤的发展进程呈升高趋势。有研究发现，K-ras基因突变能造成细胞内信号传导通路的改变，主要是K-ras基因突变后，其编码的Ras蛋白三磷酸鸟苷（GTP）水解酶活性下降，与Ras蛋白结合的GTP不能被水解，信号通路持续活化，导致肿瘤发生［15］。由此可见，K-ras基因在结直肠癌的发生发展中起重要作用，并与结直肠癌的治疗密切相关。EGFR处在K-ras信号通路上游，可作为治疗结直肠癌的一个靶点。但由于K-ras基因突变，Ras蛋白持续活化，阻断上游EGFR仍无法抑制MAPK的活化，因此，2009年NCCN指南提出EGFR拮抗剂西妥昔单抗和帕尼单抗不能用于携带K-ras突变型基因的结直肠癌患者。

根据K-ras基因突变造成肿瘤细胞内信号传导通路改变的特性，从Ras通路下游寻找新的化疗靶点，是继发现K-ras基因突变以来的又一研究热点。Ras下游信号转导通路众多，包括MAPK通路、Rho/Rac通路及未知通路。MAPK通路是目前研究较为深入的信号通路之一，它是核内激活转录因子的重要级联反应通路，它连接着细胞外信号与细胞G1期进展，同时也是多个信号通路的共同交汇点，参与调控细胞的增殖、分化、凋亡及转移侵袭等生物学行为［16］。Ras/MAPK通路的异常激活会导致细胞的无限增殖、异常分化、寿命延长及促进组织血管形成等，与结直肠癌的发生关系密切［17］。目前被广泛接受的Ras/MAPK信号传导通路为EGFR-Ras-Raf-MEK-MAPK-细胞生长，Ras在这个转导通路里主要扮演着将EGF与MAPK通路偶联的角色。在K-ras基因突变型结肠癌中，Raf-MEK-ERK通路表现出高活性状态，导致肿瘤细胞无限增殖、抗凋亡、去分化及侵袭转移能力增强。因此，抑制Raf-MEK-ERK通路任意一种激酶都有可能抑制肿瘤的生长［18-19］。本研究结果显示：以苦参碱处理K-ras基因突变型结肠癌SW480细胞后，苦参碱对ERK/MAPK通路中关键激酶MEK1/2有明显的抑制作用，和空白对照组比较，MEK1/2蛋白表达下降，差异有统计学意义（P＜0.05），并呈浓度依赖性。

综上所述，苦参碱可抑制K-ras基因突变型结肠癌细胞的生长，并能有效促进其凋亡，抑制细胞移行，其作用机制与MEK1/2表达水平下调密切相关。但是，本研究仅从细胞水平对苦参碱的抗结直肠癌作用及机制进行初步的探讨，有待进行动物体内实验，为苦参碱在临床上的应用进一步提供相关的实验依据和理论基础。

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【责任编辑：侯丽颖】

Inhibitory Effect of Matrine on K-ras Gene Mutation Colon Cancer and Its Anti-tumor Mechanism

ZOU Liaonan，MO Delong，CHEN Guobin，DIA ODechang，HE Yaobin，ZHU Wei
（Dept.of Gastrointestinal Surgery，Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510120 Guangdong，China）

ObjectiveTo observe the inhibitory effect of matrine on K-ras gene mutation colon cancer，and to clarify the inhibitory mechanism.Methods SW480 cells were treated with different concentrations of matrine. MTS method was used to detect the proliferation of SW480 cell lines.The apoptosis of SW480 cells was measured by flow cytometry.The migration of SW480 cells was examined by the scratch test.The expression of MEK1/2 protein was detected by Western blotting method.Results Compared with the blank control group，matrine（0.125-1 mg/mL）could inhibit the growth and proliferation of human colorectal cancer SW480 cell lines，promote the apoptosis， restrain the migration of SW480 cells，and inhibit the expression of MEK1/2 protein（P＜0.05），the effect showing a dose-dependent trend.Conclusion Matrine can effectively inhibit the proliferation and migration of SW480 cells，and promote SW480 cell apoptosis through the down-regulation of MEK1/2 protein expression in MAPK signal pathway system.

matrine/pharmacology；coloncancer/TCDtherapy；proteinexpression；K-ras；MEK1/2；cell culture

R285.5

A

1007-3213（2016）05-0703-07

10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．05．020

2016-02-02

邹瞭南（1977-），男，硕士研究生，副主任医师；E-mail:chenwenliang2014@163.com

广东省科技计划项目（2015A030401082）；广东省科技厅自筹经费项目（编号:粤科规财字［2015］110号）