紫地榆中鞣花酸和没食子酸含量测定

邹绒弟，骆婷婷，苏　敏，赵飞亚，周　萍

（大理大学药学与化学学院，云南大理　671000）

紫地榆中鞣花酸和没食子酸含量测定

邹绒弟，骆婷婷，苏敏，赵飞亚，周萍*

（大理大学药学与化学学院，云南大理671000）

目的：建立紫地榆中鞣花酸和没食子酸的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法，Thermo C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱，检测波长为260 nm，流速1.0 mL/min，柱温为30℃。结果：鞣花酸在6.38～31.88 μg/mL范围内r=0.999 1及没食子酸在11～55 μg/mL范围内r=0.999 1线性关系良好，平均回收率为99.2%（RSD为1.9%）和97.6%（RSD为1.5%）。结论：本法操作简便、快速、重现性好，能够有效的测定紫地榆中鞣花酸和没食子酸的含量。

紫地榆；鞣花酸；没食子酸；高效液相色谱法

［DOI］10. 3969 / j. issn. 2096-2266. 2016. 06. 012

紫地榆（赤地榆）Geranium strictipes R.Kunth.为牻牛儿苗科老鹳草属（Geranium L.）植物，药用部位为其根，具有清热利湿，活血止血等功能，主要用于治疗厌食、肠炎、痢疾、消化不良、鼻衄、外用跌打损伤等〔1〕，民间又叫隔山消，主要分布于云南中甸、永宁、永胜、大理等地区，其药源丰富，长期以来被云南的白族、彝族等少数民族广泛使用〔2〕。紫地榆在抗菌作用方面的报道显示其活性与其主要成分鞣质类有关〔3-4〕，鞣质的水解产物包括没食子酸和鞣花酸〔5〕，鞣花酸和没食子酸具有抗肿瘤、抗氧化及抗菌等作用〔6-7〕。骆婷婷等〔8〕对紫地榆中总鞣质含量进行了测定，肖培云等〔9〕对隔山消中没食子酸进行了含量测定。为后续紫地榆药材质量控制及开发利用提供参考，本实验采用HPLC法，同时测定紫地榆药材中的两种主要活性成分鞣花酸、没食子酸的含量。

1　仪器与试药

1.1仪器Agilent 1200高效液相色谱仪，Thermo C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；梅特勒电子天平（AE240瑞士），FA2004N电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；SSY-4电热恒温水浴锅（北京泰克仪器有限公司）；HH-S2s恒温水浴锅（金坛市环保仪器厂）。

1.2试剂及药品紫地榆药材于不同年份、不同时期购自大理药材市场，由大理大学药学与化学学院杨月娥老师鉴定为牻牛儿苗科老鹳草属植物（G.strictipes）的根，药材自然干燥后粉碎，过80目筛备用。没食子酸对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-13040103），鞣花酸对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-1211090），甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2.1色谱条件Thermo C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液梯度洗脱，洗脱程序见表1。流速为1 mL/min，检测波长260 nm，柱温为30℃，进样量10 μL。色谱图见图1。

表1洗脱程序

图1　混合对照品（A）与紫地榆样品（B）的HPLC色谱图

2.2样品制备

2.2.1对照品溶液的制备精密称取没食子酸和鞣花酸对照品适量，甲醇溶解制成浓度为0.220 0 mg/mL，0.127 5 mg/mL的对照品储备液。

2.2.2供试品溶液的制备取粉碎后的2012年（1）紫地榆样品，约0.25 g，精密称定，加入10 mL的70%乙醇，加热回流2 h，提取1次，过滤，定容到100 mL，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得。

2.3线性关系的考察精密移取“2.2.1”项下没食子酸和鞣花酸对照品储备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL置于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混合均匀，配成系列浓度的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，以峰面积（Y）为纵坐标，对照品质量浓度（X）为横坐标进行线性回归，得回归方程，没食子酸为Y=13 882X-1.1，r=0.999 1；鞣花酸为Y=79 373X-136.8，r=0.999 1。结果表明鞣花酸和没食子酸分别在6.38～31.88 μg/mL和11～55 μg/mL范围内线性关系良好。

2.4仪器精密度试验取混合对照品溶液（没食子酸33μg/mL，鞣花酸19.12μg/mL），按“2.1”项下色谱条件，进样10 μL，重复进样6次，测得没食子酸和鞣花酸峰面积的RSD值均为1.0%，表明仪器精密度良好。

2.5稳定性试验取同一供试品溶液，置于室温下，分别于1、2、4、6、8、24 h，按“2.1”项下色谱条件测定，结果没食子酸和鞣花酸峰面积的RSD分别为1.4%，0.6%，说明供试液室温下放置24 h内稳定。

2.6重复性试验取2012年（1）紫地榆样品5份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算含量，结果没食子酸和鞣花酸峰面积的RSD分别为2.5%，1.8%，说明该方法的重复性良好。

2.7加样回收率试验取已知含量（没食子酸1.40 mg/g，鞣花酸6.50 mg/g）的2012年（1）紫地榆样品5份，每份约0.13 g，分别加入没食子酸和鞣花酸对照品适量，按“2.2.2”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件测定。见表2。

2.8样品的测定取不同批次紫地榆样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液按“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积并计算没食子酸和鞣花酸含量。见表3。

表2　没食子酸和鞣花酸的加样回收率结果（n=5）

表3　样品测定结果（n=3）

3　讨论

3.1检测波长的选择有文献报道没食子酸在274、272 nm处，鞣花酸在280、254 nm处有最大吸收〔10-12〕，为进一步确定波长，将两种物质分别在200～400 nm进行扫描，测得没食子酸最大吸收波长为278 nm，鞣花酸最大吸收波长为254 nm，由于最大吸收波长有着差距，混合对照品后采用HPLC法进样观察检测器（DAD）记录的图谱，在260 nm处两个物质都相对有较大的吸收，故选择260 nm为同时测定两种成分的波长。

3.2色谱条件的选择在参考文献〔11-13〕的基础上，分别考察了不同流动相（甲醇-水系统、乙腈-水系统），不同柱温25、30℃，不同色谱柱（C8、C18）下没食子酸和鞣花酸的分离情况，结果使用Thermo C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温30℃，甲醇-0.1%磷酸溶液梯度洗脱时，没食子酸和鞣花酸能很好的分离，同时紫地榆中其他成分不干扰主成分的测定。

3.3含量差异紫地榆含量测定结果表明，提取方法相同的情况下，不同样品中鞣花酸含量均明显高于没食子酸含量，两者的含量在不同批次中也有差异，鉴于紫地榆常年生于海拔2 600～3 800 m的草丛或灌丛中〔2〕，其所含鞣花酸和没食子酸的含量可能与云南中甸、大理等地区的海拔、气候、生长条件、采样时间等因素有关。而这些条件有待进一步的考察研究。

〔1〕《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编：下册〔M〕.北京：人民卫生出版社，1983：624．

〔2〕朱永红，吕盼.民族药紫地榆研究进展〔J〕.云南中医学院学报，2012，35（3）：20-22.

〔3〕李龙星，郭利军，蓝海.紫地榆对口腔致龋菌抑制作用的研究〔J〕.安徽农业科学，2010，38（36）：20600.

〔4〕耿玲，陈俊雅，李洪文，等.紫地榆提取物体外抗菌活性研究〔J〕.大理学院学报，2014，13（10）：14-17.

〔5〕杨国红，陈道峰.紫地榆的化学成分及其抗艾滋病病毒活性〔J〕.中草药，2007，38（3）：352-354.

〔6〕汪莹莹.没食子酸、并没食子酸的分离、性能及应用研究〔D〕.合肥：安徽大学，2012.

〔7〕盛达成，陈凌，王文茂，等.高效液相色谱法同时分析五倍子提取物中的没食子酸和鞣花酸〔J〕.中国农学通报，2013，29（4）：148-154.

〔8〕骆婷婷，蓝海，张海珠，等.紫地榆中总鞣质的含量测定〔J〕.大理学院学报，2014，13（2）：12-14.

〔9〕肖培云，蓝海，李龙星.HPLC法测定隔山消中没食子酸的含量研究〔J〕.大理学院学报，2009，8（6）：9-11.

〔10〕徐佳丽，苏柘僮，陈龙，等.HPLC测定地榆鞣质提取物中游离没食子酸的含量〔J〕.中国实验方剂学杂志，2012，18（20）：84-86.

〔11〕樟木，朱少娟，严泽民.HPLC测定地榆中没食子酸和鞣花酸的含量〔J〕.现代科学仪器，2009，10（5）：69-70.

〔12〕金欣，王峰，姚岚.HPLC测定野老鹳草中没食子酸和鞣花酸的总量〔J〕.中成药，2012，32（7）：1172-1176.

〔13〕刘明，席亚妮，陈国强.绿茶中没食子酸的提取工艺研究〔J〕.饮料工业，2012，15（10）：29-31.

〔Abstract〕Objective：To establish a method of determining the content of ellagic acid and gallic acid in Geranium strictipes. Methods：HPLC method was used with Thermo C18chromatography column（250 mm×4.6 mm，5 μm）.Mobile phase was methanol-0.1%phosphoric acid water solution gradient elution，the detection wavelength was 260 nm，the flow rate was 1.0 mL/min，and the column temperature was 30 degree.Results：Ellagic acid in 6.38-31.88 μg/mL range r=0.999 1 and gallic acid in 11-55 μg/mL range r=0.999 1 showed a good linear relationship.The average recovery rate was 99.2%（RSD=1.9%）and 97.6%（RSD=1.5%）.

Conclusion：This method is simple，rapid，accurate and good in reproducibility，which can effectively determine the content of ellagic acid and gallic acid in Geranium strictipes.

〔Key words〕Geranium strictipes；ellagic acid；gallic acid；HPLC

（责任编辑李杨）

Determination of the Content of Ellagic Acid and Gallic Acid in Geranium strictipes

Zou Rongdi，Luo Tingting，Su Min，Zhao Feiya，Zhou Ping*
（College of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China）

R284

A

2096-2266（2016）06-0047-03

省级创新创业训练计划建设基金资助项目（S-CXCY-2014-4）

2015-11-12

2015-12-17

邹绒弟，药学专业2012级本科生.

周萍，教授.