化合物萘对斑马鱼(Daniorerio)发育毒性及基因组DNA甲基化影响的研究

陈宏姗，盛连喜，边红枫

(东北师范大学国家环境保护湿地生态与植被恢复重点实验室，吉林 长春 130117)



化合物萘对斑马鱼(Daniorerio)发育毒性及基因组DNA甲基化影响的研究

陈宏姗，盛连喜，边红枫

(东北师范大学国家环境保护湿地生态与植被恢复重点实验室，吉林 长春 130117)

萘作为最简单的多环芳烃化合物，对水生生物有致死致畸作用，并能破坏生物的抗氧化防御系统.选用模式生物雌性斑马鱼成体和胚胎为受试对象进行了萘暴露处理.斑马鱼胚胎发育从受精后3 h开始进行萘溶液染毒处理，处理浓度分别为0(对照组)，1.5，2.5和7.5 μg/L(3个处理组)，至受精后96 h结束.染毒期间观察胚胎发育的毒理学终点.成年雌性斑马鱼暴露在0，84，840 μg/L的萘溶液中96 h.研究结果表明，萘对斑马鱼胚胎具有发育毒性，受精后24 h凝结率及中枢神经发育异常，有明显的浓度依赖性.甲基化敏感扩增多态性(MSAP)方法检测肝脏、脑和肌肉组织受萘胁迫后DNA甲基化水平变化的结果表明，肝脏和脑中DNA甲基化变化水平较肌肉组织高.在肝脏中，DNA甲基化变化水平较对照组分别高出12.88%(84 μg/L处理组)和8.16%(840 μg/L处理组).

多环芳烃；萘；斑马鱼；表观遗传；DNA甲基化；MSAP

随着现代工业、农业的快速发展，新型化合物的种类正在不断增加，一些残留期长、环境毒性大或毒性较低但难以分解的化合物，尤其是在环境中长时间积累并对人类健康和周边生物构成严重威胁的持久性化合物(POPs)，如PBDEs，PFOS，PEE以及PAHs等，都属于此类化学物质.多环芳烃化合物(polycyclic aromatic hydrocarbon，PAHs)是1976年美国环保署(EPA)列出的16项优先控制污染物之一，我国1990年提出的68种水体优先控制污染物中就有7种属于PAHs.它们对生物具有致癌、致畸、致突变的作用，且物理化学性质稳定，在自然界中难于降解，也是最早被发现和研究的化学致癌物之一[1-2].据统计，到2013年其总排放量已达53万t[3].萘(naphthalene)是相对分子质量最低的PAHs类化合物，进入水生生态系统的主要渠道是煤焦油生产和蒸馏过程的后续排放以及石油产品和副产品的泄漏[4].20世纪七八十年代，萘作为工业材料被用做家用杀虫药(樟脑丸)[5].萘的毒性虽然较低，但分布较广，对光氧化有较低的敏感性，在水体中有较长的持久性[6]，故也属于PAHs类污染物，成为环境毒理学和生态毒理学研究中备受关注的化学物质之一.

伴随着环境问题出现的新变化，研究环境中各种有毒、有害污染物的损害作用及其机理的一门新型交叉学科——生态毒理学发展快速，并成为环境风险管理和环境决策的科学依据和重要基础[7].这个新学科的形成与方法学的不断完善密切相关.生物标记法、免疫组织化学法、组学技术(包括蛋白质组学、代谢组学、转录组学)等研究方法不断完善和发展，推动了分子生态毒理学的形成和发展.其中，化合物对DNA损伤是分子生态学研究的重要内容[8].DNA甲基化测定则是判断其损伤程度的主要方法.

DNA甲基化是表观遗传过程的最重要特征之一，能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达，环境因子通过影响表观遗传方式可直接或间接地造成基因表达的改变.一定条件下，DNA甲基化具有可逆性，因而也被称为“生物进化系统中抵抗环境改变的缓冲器”[9].近10 多年来，该技术因通用性强、操作相对简便等优点而在毒理学研究中得到了应用[10].刘莉莉等[11]的研究证实，5-脱氧杂氮胞苷可造成DNA的低甲基化；杨建平等[9]对致癌化学污染物的研究发现，TCE，DCA，TCA可诱导小鼠原癌基因表达量上升，同时伴有DNA去甲基化的发生；而在重金属对鱼体内DNA甲基化影响的研究中发现，Cu，Zn，Pb，Cd及其混合重金属离子能明显提高鲫鱼肝脏DNA、泥鳅DNA的总甲基化水平，且影响程度与Cd，Pb的性质、质量浓度及其作用的靶器官具有相关性[12-13].许多研究证实，甲基敏感扩增多态性实验(methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP)是检测基因组甲基化水平的理想方法，并被广泛地应用于动、植物基因组的甲基化检测中[14].

由于鱼类可以从水环境中吸收亲脂性的有机污染物，因此很多生理效应的变化都可以作为鱼类摄入有毒物质后的警示指标，如胆汁代谢物、抗氧化防御系统酶类、微粒体单加氧酶、谷胱甘肽-S-转移酶水平等生理效应的变化都能作为多环芳烃评价的生理指标[15].此外，这些化合物经过鱼类的生物转化后，导致突变或其他类型遗传物质的损害[16]；DNA加合物也可以作为损伤性生物标志物来评价污染物的遗传毒性[17].

斑马鱼(Daniorerio)作为研究对象用于毒理学研究开始于20世纪50年代；90年代后，斑马鱼作为脊椎动物模式生物开始得到广泛应用，我国的斑马鱼研究也在此后开始进入快速发展期，涉及毒理学研究的文章比例也较高[18].但从表观遗传学视野开展的毒理学研究，特别是有关环境污染物危害的表观遗传学研究还相对较少.本文以模式生物雌性斑马鱼成体及胚胎(幼鱼)为受试对象，探究了萘对成鱼各器官基因组DNA甲基化修饰水平及幼鱼发育的影响，探讨了由此而产生的表观遗传学毒性发生机制及其与有毒重金属所产生的表观遗传学改变的异同，以为生态毒性评价提供科学依据.

1　材料与方法

1.1斑马鱼萘暴露处理实验

1.1.1成年斑马鱼萘暴露处理

选取体重、体长均一的成年雌性斑马鱼(Tubingen品系)，体长(4.0±0.04)cm、体重(0.5±0.02)g，每浓度处理组5尾，设3组重复.实验容器为5 L烧杯，各组溶液由两种母液添加海水盐稀释而成，总体积4 L，每24 h更换溶液.成年雌性斑马鱼暴露预实验步骤参照鱼类化学暴露标准方法实施[19]，以确定萘对斑马鱼96 h的LC50值.萘为分析纯，CN NO.4151；二甲基亚砜(DMSO)，CN NO.82001.先分别配制成84和840 μg/mL萘-二甲基亚砜母液，室温避光保存.依据毒性预实验的结果，处理浓度设为溶剂对照组(0.01%二甲基亚砜)，84 μg/L和840 μg/L萘溶液处理组.投入实验用鱼，28℃培养96 h.实体解剖镜下分别取每个处理组斑马鱼的肝脏、脑和肌肉组织的材料，保存于RNA Store溶液(天根生化科技(北京) 有限公司)中，置于-20℃冰箱，备用.

1.1.2胚胎萘暴露处理

胚胎毒性试验设计参照国际标准操作指南进行[20].选用发育状态良好，体长(4.0±0.04)cm、体重(0.5±0.02)g的成年斑马鱼，交配后选出发育完好的受精卵，待发育稳定至受精后3 h进行胚胎的静态染毒.选用6孔细胞培养板，每孔加入10 mL的对照溶液(0.01%)二甲基亚砜或萘溶液(含0.01%二甲基亚砜).萘暴露处理的浓度分别为 0，1.5，2.5，7.5 μg/L；每个孔内放30枚受精卵，每个浓度设3个平行.然后，将受试胚胎置于27℃的光照培养箱中孵化，光暗比为14/10 h. 染毒后，在倒置显微镜下观察发育至受精后24(24 h pf)，48，72，96 h后的胚胎和幼鱼的发育毒理学终点，包括受精后24 h胚胎凝结率、48 h跳速率、72 h神经反射能力和96 h幼鱼存活率.

1.1.3数据处理与统计分析

实验结果以3个平行组的平均值±标准差表示.对每种毒理学指标，采用Origin Lab软件在对照组和受试组之间进行Oneway-ANOVA分析，P<0.05时认定为存在显著性差异.

1.2试剂盒法提取斑马鱼肝脏基因组总DNA

取0. 3 g斑马鱼肝脏样品，按照试剂盒的使用说明提取，最后离心收集得到基因组DNA样本，-20℃ 冻存备用.DNA提取试剂盒购买于天根生化科技(北京) 有限公司.

1.3甲基敏感扩增多态性实验

MSAP实验参考赵娜[21]所采用的方法和实验步骤进行，包括基因组DNA限制性酶切及连接、预扩增、选择性扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染检测、条带统计和数据整理等.

1.3.1限制性酶切及连接

酶切连接前一天将相应接头的两互补链1∶1混合，并使EcoRI接头和HpaII/MspI接头的10倍母液，终浓度分别为25，250 pmol/μL.双酶切及连接体系包括：5%接头，1倍反应缓冲液(reaction buffer)，500 ng模板基因组DNA，1 U的EcoRⅠ，1 U的HpaⅡ/MspⅠ，1 U的T4 DNA连接酶(ligase)，其余为PCR级别实验用水.37℃保温5 h，8℃保温4 h，4℃过夜.

1.3.2预扩增

以酶切连接产物为模板进行预扩增，反应体系25 μL.之后，94℃预变性5 min，按以下参数扩增 30 个循环：94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s.扩增后72℃再延伸 10 min.用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，在200～1 000 bp范围内DNA呈弥散状分布为最佳酶切连接结果.根据DNA弥散带的亮度，用0.1×TE 缓冲液(buffer)稀释预扩增产物10倍至40倍，作为选择性PCR扩增的DNA模板.

1.3.3选择性扩增

混匀体系后，按下列参数进行PCR扩增反应：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸80 s；以后每轮循环温度递减0.7℃或1℃，扩增12或10轮.而后马上进行94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸80 s，扩增25个循环；扩增后72℃延伸10 min.

1.3.4变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染

将以上体系PCR 扩增后的产物进行4%聚丙烯酰胺凝胶电泳及硝酸银染色.

1.3.5条带统计及分析

根据银染结果统计扩增结果，比较暴露组和对照组在同一等位位点的扩增情况，有条带记为1，无条带记为0.

2　实验结果

2.1萘对斑马鱼的急性毒性半致死浓度

根据预实验结果，计算出雌性斑马鱼在萘-二甲基亚砜溶液暴露下的半数致死浓度(LC50)值(见图1A).从图1可以看出，雌性成年斑马鱼的96 h LC50值为8.4 mg/L，而且萘对斑马鱼毒性作用存在明显的剂量-效应关系.暴露实验过程中，对照组未出现异常症状；而暴露组加入萘溶液染毒2 min后，斑马鱼表现出异常跳跃、游动不平衡、死亡增高等现象，而且死亡的个体腮部均有明显充血症状，这些中毒反应症状的程度随着萘浓度的升高而越发明显.

图1　成年斑马鱼及胚胎-幼鱼暴露96 h的存活率

萘对斑马鱼胚胎及幼鱼发育毒性实验结果表明，其96 h LC50为30.8 μg/L(见图1B)，对受精后24 h 卵凝结率、48 h心脏功能水平、72 h神经反射发育水平与96 h幼鱼成活率的影响结果见图2.斑马鱼胚胎于受精后3 h暴露于萘-二甲基亚砜溶液和空白对照后，24 h卵凝结率与72 h神经发育水平变化与处理浓度表现出明显的浓度依赖性.空白对照及1.5 μg/L处理组对卵凝结率及神经发育未产生明显影响(<5%)；浓度增加至7.5 μg/L时，24 h卵凝结率达到42.5%；染毒至受精后72 h，2.5 μg/L和7.5 μg/L处理组只有32.5%和28.5%的幼鱼有正常的神经发育，这表明，两个浓度组中萘对斑马鱼胚胎和幼鱼的中枢神经系统发育均有一定影响.各处理组在受精后48 h心脏发育水平上均并未发现异常.受精后96 h成活率对照组为82.5%；7.5 μg/L 处理组的斑马鱼胚胎其存活率下降到65%，而1.5 μg/L 处理组则高达到90%.毒物的这种“低浓度刺激效应”在许多毒理学研究中都有所发现[22-23].

A 24 h卵凝结率，B 48 h心脏发育水平，C 72 h神经发育水平， D 96 h幼鱼成活率.

2.2MSAP结果

利用MSAP检测方法得到了雌性斑马鱼不同组织的甲基化图谱，结果显示出3种条带类型：Ⅰ型是条带在H(HpaⅡ/ EcoR I)和M(MspⅠ/EcoR I)两个泳道同时出现，表明CCGG位点没有甲基化；Ⅱ型是条带只在H泳道出现，在M泳道缺失，表明CCGG位点半甲基化；Ⅲ型则是条带在H泳道缺失，而在M泳道出现，表明CCGG位点全甲基化.根据电泳显示的结果，每个泳道有20～30个片段，长度为50～1 500 bp.其中，条带清晰的长度为100～750 bp的片段，占总条带数的90%以上，将这部分片段作为“有意义片段”， 统计雌性斑马鱼3个组织全基因组DNA在CCGG未甲基化的位点、全甲基化的位点和半甲基化的位点占总位点数的比率，结果见表1.

从表1可知，斑马鱼暴露于不同浓度的萘处理组后，各组织中基因组DNA甲基化水平均发生了不同程度的变化.在萘-二甲基亚砜染毒96 h后，斑马鱼肝脏中DNA甲基化水平显著升高，低浓度处理组(84 μg/L)基因组总甲基化水平达到45.57%，高浓度(840 μg/L)处理组达到了40.85%，分别比对照组升高了12.88%与8.16%.其中，对照组CCGG位点全甲基化16.69%，半甲基化16%；低浓度处理组CCGG位点全甲基化20.8%，半甲基化24.77%；高浓度处理组CCGG位点全甲基化19.51%，半甲基化21.34%.

脑组织的DNA甲基化水平变化趋势与肝脏较为一致，低浓度处理组(84 μg/L)基因组总甲基化水平达到42.94%，高浓度处理组(840 μg/L)达到39.25%，分别比对照组升高了11.16%与7.91%.其中，对照组CCGG位点全甲基化14.21%，半甲基化17.13%；低浓度处理组CCGG位点全甲基化26.69%，半甲基化16.26%；高浓度处理组CCGG位点全甲基化22.12%，半甲基化17.13%.

表1　雌性斑马鱼组织基因组DNA甲基化水平分析检测结果

肌肉组织的两个处理组及对照组之间甲基化水平基本没有差别，全甲基化和半甲基化位点比例也无差别.但与肝脏和脑组织的甲基化水平相比，肌肉组织的甲基化水平相对较低.

3　讨论

胞嘧啶甲基化是脊椎动物重要的表达调控手段，可以抑制相关基因的表达，而且通常呈负调控[24].正常情况下，CpG二核苷酸占有人类基因组的10%，其中70%～80%都为甲基化的CpG位点.未甲基化的CpG二核苷酸仅占全部的2%～3%，通常定位于5末端的启动子区域，也可以延伸到基因的外显子区域，以CpG岛的形式存在[25].启动子区DNA甲基化与组蛋白去乙酰化之间具有协同抑制基因转录的作用，在功能上等同于遗传改变，如碱基的突变和缺失[26].DNA甲基化修饰已被确认为是动物癌症发生过程中的重要机制之一[27].研究表明，癌症相关基因启动子区都存在异常的DNA甲基化，说明致病基因表达或关闭都与胞嘧啶甲基化有关[28].已有研究证实，斑马鱼P53基因是化学诱变物的主要攻击位点，它的突变很可能是肿瘤产生的主要因素[29].本研究中，斑马鱼在遭受到萘急性暴露处理后，各组织CCGG位点甲基化变异水平在高低浓度之间并无显著性差异.其肝脏及脑组织中甲基化水平明显升高，可能是很多基因的表达已经被表观遗传的这种调控方式关闭所致.这一结果表明，作为PAHs类化合物的萘造成斑马鱼甲基化变异影响的主要是肝脏与脑，其对神经发育及肝脏致癌作用的潜在危害是不容忽视的；但另一方面，胞嘧啶CCGG位点甲基化水平如何作为定量的生物标记还有待于深入研究.

有毒重金属也可以导致斑马鱼DNA甲基化，而且这方面的研究开展得比较早.朱国念等[12]的研究认为，有毒重金属也是通过对DNA甲基化水平以及组蛋白的修饰发挥作用的，可能的调控机制是其离子的胁迫导致鱼组织的脂质产生过氧化作用，使活性氧自由基不能被清除导致代谢受阻，并引发了DNA链的断裂损伤.因此，重金属引起DNA的甲基化水平升高可能是细胞保护DNA链不被降解的一种自调节方式.相对于重金属，PAHs污染物萘由于其辛醇-水分配系数较低，因而更容易在水生生物体内富集，能够引起稳态失调，进入细胞后可能与细胞质中的芳香烃受体(AHR)结合并使之激活后发生构象改变，从而产生相应的生物学效应[30].萘的胁迫可使许多酶如脂质过氧化酶、过氧化氢酶、乙酰胆碱酯酶和谷胱甘肽等重要生化酶类水平的降低[31]，这将导致更多的自由基产生.可见化学污染物的物理化学性质使其参与体内生化反应更直接，影响可能更广泛.王丽等[32]的研究结果也表明，甲醛参与DNA甲基化可能是通过参与体内四氢叶酸循环实现的.所以，高甲基化水平也预示着DNA分子的过度修饰可能引起其结构和活性受到损害.这虽然与有毒重金属致毒作用的最终结果相似，但作用机制和路径可能有所不同，这也是下一步需要研究证实的问题.

以往的研究证明，大部分有机污染物都要经过肝脏参与氧化还原代谢，因而肝脏被认定为多种污染物侵害的靶器官.所以，在一定剂量-时间作用下，也可以根据不同组织器官表观遗传调控水平的差异来推断毒物主要攻击的靶器官.在本研究中，萘暴露后，斑马鱼肝脏中DNA甲基化水平相对于脑和肌肉组织的变化更为显著，这可能与肝脏的器官功能有关，使其对污染物吸收富集的数量较其他两个组织更多.有研究证实，成年雄性斑马鱼暴露于DBP(500 μg/L)7 d或15 d，其肝脏过氧化物酶体增殖[33].肝脏通过生物转化作用，将有毒物质降解并转化为没有活性的基团，使其不能再参与其他的代谢反应，这对于机体的生命活动至关重要，也是保护其他组织和器官的一种有限的“利他”机制.本研究检测到的变异水平是全基因组范围DNA甲基化水平，在两个处理浓度胁迫下，随着浓度增加甲基化水平变异幅度减小，如再逐渐增加浓度最后可能导致甲基化水平趋于稳定，表现出对污染物不再敏感.这可能是由于器官严重损伤或坏死，因而检测不到变异后表现出的所谓的一种对污染物的“适应行为”.

由于表观遗传的调控方式对环境污染物的刺激更为敏感，这在一定程度上对基因组具有保护作用，使外界刺激不能直接作用于遗传信息，并形成了一道可自动调节与恢复的“屏障保护系统”.当这种系统的调节机制与功能无法发挥作用时，有机污染物就将对机体进入更深层次的和不可逆转的侵害过程.所以，有必要筛选表观遗传调控的生物标记，而且DNA甲基化作为一种监测环境污染物诱导疾病发生的新型分子生物学指标，有可能被应用于诊断、病情监控和预后评价等方面[34].目前的研究已表明肿瘤作为一种基因病，是环境和遗传的致癌因素所导致的细胞的非致命性损伤，因为它们可以活化原癌基因或使抑癌基因失活.而DNA甲基化也是调控癌症相关基因表达的重要方式，尤其是在CpG岛甲基化水平的调控方面.

4　结论

本文的研究结果表明，斑马鱼不同组织DNA甲基化水平的变异与萘胁迫有直接关系，并可在短期内做出迅速反应，说明用DNA甲基化水平变化来评价萘的毒性影响是可行的.依据“中心法则”DNA→mRNA→蛋白质的信息传递路径，DNA水平调节的评价指标较基因表达水平、酶学水平上的调节将更早也更敏感.因此，以表观遗传学方法筛选更灵敏的生物标示物，探测多环芳烃对机体健康伤害后的早期生物学变化将是毒理学研究的一个新方向.本文的研究结果证实，受到萘的胁迫后不同组织出现了各具特异性的甲基化变异，这些变异位点可能就是污染物对该组织器官损伤的甲基化调控热点及癌症发生的先前突破点.这些位点的变异是否对同类多环芳烃污染物都有相同的指示趋向性，它们参与了哪些基因表达的调控，将是今后需要关注的重要问题.

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(责任编辑：方林)

Investigation of the effects of developmental toxicity and genomic DNA methylation upon naphthalene exposure in zebrafish(Daniorerio)

CHEN Hong-shan，SHENG Lian-xi，BIAN Hong-feng

(State Environmental Protection Key Laboratory of Wetland Ecology and Vegetation Restoration，Northeast Normal University，Changchun 130117，China)

The naphthalene as the simplest PAHs(polycyclic aromatic hydrocarbons)，is considered to be lethal and teratogenic effects on aquatic organism，also refers to the disruption of antioxidant defense system function. In the present study，adult female zebrafish(Daniorerio) and embryo(Tubingen line) were used to naphthalene exposure tests. Zebrafish embryos were exposed to different concentrations of naphthalene(0，1.5，2.5，7.5 μg/L) from 3 h post-fertilization(hpf) to 96 h pf. During the exposure period，embryo developmental endpoints were examined by microscope. The adult zebrafish were exposed to 0，84 μg/L and 840 μg/L of naphthalene for 96 h. Exposure to naphthalene caused a developmental toxicity，including reduced survival，increased coagulation rates and abnormal 72 h pf response ability in a dose-dependent manner. After the naphthalene exposure，used the MSAP(methylation sensitive amplification polymorphism) analysis to measure the DNA methylation level changes in adult female zebrafish liver，brain and muscle. Higher DNA-methylation level changes showed in the liver and brain than that in muscle. Especially in the liver，DNA methylation level changes in treatment groups are 12.88%(84 μg/L) and 8.16%(840 μg/L) higher than that in control groups respectively.

polycyclic aromatic hydrocarbon;naphthalene；MSAP;zebrafish；epigenetic;DNA methylation

1000-1832(2016)03-0167-07

2015-05-12

国家水体污染控制与治理科技重大专项项目(2008ZX07207-009-03).

陈宏姗(1985—)，女，博士研究生；通讯作者：盛连喜(1961—)，男，教授，博士研究生导师，主要从事于环境生态与湿地保护研究.

X 171.5[学科代码]610·1040

A

[DOI]10.16163/j.cnki.22-1123/n.2016.03.030