微生物四项检测仪与多管法的对比及应用

高心岗　张　芳

(青岛佳明测控科技股份有限公司，青岛 266000)



微生物四项检测仪与多管法的对比及应用

高心岗张芳

(青岛佳明测控科技股份有限公司，青岛 266000)

微生物四项检测仪是基于国标方法酶-底物法研制的，可以同时检测水体中菌落总数、总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌四项指标的快速检测设备。本研究采用该微生物四项检测仪，用标准菌液对仪器本身性能进行了验证，并采用多点采集的饮用水及水源水水样进行了微生物四项指标的测定，仪器检测结果与国标传统方法中的多管发酵法进行了对比。结果显示该检测仪的测定结果与多管发酵法具有较好的相关性，能满足多种水样实际检测的要求，具有操作简单、检测周期短(大肠菌群 ≤12h、菌落总数≤18h)、灵敏度高、结果可靠等优点，可用于对饮用水及水源水常规微生物四项指标的快速检测及筛查，并起到预警作用。

水中微生物菌落总数检测仪快速测定

生活饮用水的质量关系着千家万户人民的身体健康，随着环境污染日益严重，关乎人们身体健康的饮水问题也变得越来越重要。生活饮用水的安全饮用微生物标准检验方法规定了菌落总数、总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌等四项常规检测指标，并规定饮用水中菌落总数不得超过100CFU/mL；而当饮用水中总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌一旦检出就意味着该饮用水已被污染，不得饮用。

目前，国内普遍采用《GB/T5750.12-2006 生活饮用水标准检验方法微生物指标》来检测生活饮用水中常规四项指标，其具有准确性好、可靠性高等特点，但是前期需要做大量的实验准备工作，操作过程也较为繁琐，需要较长时间才能获得检测结果，不适用于突发性公共卫生应急事件和实时对饮用水、水源水进行全天候高频率安全监测。因此十分有必要研究适合水质常规四项微生物检测指标快速检测的方法。

微生物四项检测仪是以国标方法里的酶-底物法为原理基础研制的，可以同时检测水体中菌落总数、总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌四项指标的快速检测设备，具有操作简单、检测周期短(大肠菌群 ≤12h、菌落总数≤18h)、灵敏度高、结果可靠等优点，有较高的实用价值。本研究采用该微生物四项检测仪，用标准菌液对仪器本身性能进行了验证，并采用多点采集的饮用水及水源水水样进行了微生物四项指标的测定，仪器检测结果与国标传统方法中的多管发酵法进行了对比。结果显示该检测仪的测定结果与国标传统方法多管发酵法具有较好的相关性，能满足多种水样实际检测的要求，可用于对饮用水及水源水常规微生物四项指标的快速检测及筛查，并起到一定的预警作用。

1　材料与方法

1.1样品

实验水样品采自青岛市白沙河、青岛市崂山水库、本实验室自来水。白沙河样本与崂山水库样本取自水面下30cm处，水体置于灭菌500mL玻璃广口瓶中，封口、编号带回实验室。自来水样本取自经出水口灭菌的实验室水龙头，置于灭菌500mL玻璃广口瓶中。

1.2试剂

乳糖蛋白胨培养液、EC培养液等均购自青岛高科园海博生物技术有限公司。

1.3菌种及菌悬液制备

大肠埃希氏菌(ATCC25922)购自中国药品生物制品检定所。

将37℃培养24h的大肠埃希氏菌斜面挑取适量菌体于无菌生理盐水中，充分混合，并逐步稀释至菌悬液浓度为107～108cfu/mL待用。

1.4仪器

多管发酵法：中试管、发酵管、500mL广口瓶、玻璃培养皿、生物安全柜、高压蒸汽灭菌锅、移液管、载玻片、接种环和恒温培养箱。

微生物四项检测仪法：微生物四项检测仪JMA-SZS-MP-1，由青岛佳明测控科技股份有限公司提供。

1.5检测方法

1.5.1多管发酵法(国标法)

多管发酵法参照HJ/T347-2007《水质粪大肠菌群的测定-多管发酵法和滤膜法》，具体步骤如下：

(1)初发酵实验：

将原液作1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶100000稀释。依次吸取1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶100000各1mL分别注入内装有小发酵管和10mL乳糖蛋白胨培养液的试管中，将已接种的发酵管置于37℃恒温培养箱内培养24h。产酸产气的发酵管表明试验阳性。如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。

(2)复发酵试验

轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm接种环或灭菌棒将培养物转接到EC培养液中。在44.5℃±0.5℃温度下培养24h±2h。培养后立即观察，发酵管产气泡证实为粪大肠菌群阳性，按阳性管数查表。

1.5.2微生物快速监测仪法(仪器法)

微生物四项检测仪是基于酶-底物法为原理设计的，结合微生物、光、机、电、机械多领域技术研发而成，仪器使用一次性培养基，具有操作简便，检测速度快，准确性高等特点。测定步骤如下：把待测水样100 mL加入测试指标对应的培养检测瓶内，放入检测仪指定槽位，按操作要求设置后开始自动检测，视水样浓度高低，几个小时后结果自动在显示屏幕上出现已测水样结果。

1.5.2.1酶-底物法原理

待测微生物指标在最适温度下培养生长，产生特定的酶可水解培养基中不同的底物生成有色物质。本系统采用的培养基能够与该种特定酶生成不同的有色化合物，通过进行连续的分光光度测定，依据待测水样色度变化并与水中的待测指标成一定关系，建立相关数学模型即可得出待测微生物指标的浓度。

1.5.2.2一次性培养基

仪器通过连续光度检测培养基，根据色度变化结合算法得出最终待测指标的结果。

1.6数据分析

待测指标检测结果先转换为常用对数，然后采用下式比较两种方法之间的差异，以实际偏差小于±30%作为可接受的结果。

式中：A-多管发酵法测定结果；

B-仪器法测定结果。

将检测结果转换为常用对数，输入excel 2003，采用t检验对数据进行统计分析。

2　结果

2.1微生物四项检测仪实验室参数验证

2.1.1准确性验证

制备总大肠菌群，耐热大肠菌群，菌落总数标准品的菌悬液，菌悬液的浓度应选择为能够准确计数的最高浓度。利用微生物四项检测仪检测其生长曲线，重复6次，如图1所示。将标准菌悬液稀释8个浓度梯度，用微生物四项仪检测仪检测其生长曲线如图2所示。用微生物四项检测仪检测不同浓度菌群测得的标准曲线，如图3所示。然后系列稀释5个浓度梯度至较低浓度，每个浓度做3个平行。用多管发酵法与微生物四项检测仪法平行检测并计算加标回收率。结果如表1所示。从表1中可以看出微生物四项仪的加标回收率在83.33%～118.57%。同时从图2可以看出，该方法能在12小时内检测出低至100 CFU/mL的菌落总数及1 CFU/100mL的大肠菌群。

图1　标准菌悬液生长浓度梯度生长曲线

图2　8个梯度浓度的菌悬液生长曲线

图3　不同浓度菌群测得的标准曲线图

表1　微生物四项检测仪检测3种指标加标回收率　%

2.1.2精密性与重复性验证

制备总大肠菌群，耐热大肠菌群，菌落总数标准品的菌悬液，菌悬液的浓度应选择为能够准确读数的最高浓度，然后系列稀释5个浓度梯度至较低浓度。每一个浓度用微生物四项检测仪进行10 次平行检验，对检验结果采用统计分析方法得到相对标准偏差。结果如表2所示，标准偏差在10.95%～27.19%之间。

表2　3个水样检测标准偏差　%

2.2微生物四项检测仪对3种水样检测结果

分别以国标法和四项微生物检测仪法对3个水样的4种微生物指标进行检测并计算准确度，白沙河水样检测结果如表3所示，崂山水库水样如表4所示，自来水水样如表5所示。

表3　白沙河水样检测结果　%

表4　崂山水库水样检测结果　%

续表4

表5　自来水水样检测结果　%

3　讨论

本研究使用的微生物四项检测仪，采用酶底物法的原理，在一个仪器上实现了菌落总数，总大肠菌群，耐热大肠菌群和大肠杆菌埃希氏菌四项常规的微生物指标的同时检测，对于快速检测水质微生物污染提供了一种新的技术手段。但其具体的检测性能还没有相关的研究。

本研究首先制备了标准浓度的大肠埃希氏菌悬液来验证微生物四项检测仪的性能，从图2和图3结果可以看出，仪器测试得到的菌种生长曲线符合标准的生长曲线特点。进一步的测试显示四项检测仪的加标回收率在83.33%～117.39%。等效方法的检验结果均大于国标方法的70%。从精密性与重复性验证结果可知标准偏差在10.95%～27.19%之间，均小于35%。说明微生物四项检测仪用于水质微生物检测结果可靠，具有可行性。且同传统的国标法相比较，具有检测时间短,小于12小时，操作更为简便，无需确认实验，自动化程度高的优点。

用微生物四项检测仪对3个不同来源的实际水样进行了检测，其检测结果与国标法对比发现，准确度在-17.1%～36.5%之间，说明微生物四项检测仪具有很好的实用价值。由于其检测时间显著短于多管发酵法，该仪器可用于及时有效的发现突发性水污染事件，从而有效防止突发性公共卫生事件。

虽然在今后一段时间内，传统方法与新技术将并存的局面还难于改变，但随着科技进步，自动化检测方法将是环境监测工作的发展方向。精确、快速、可靠的检测仪器将会得到应用与普及。

[1]GB7959-1987.粪便无害化卫生标准[S].

[2]阚方琦,马乐好,王方木,薛彦明.检测食(饮)品大肠菌群纸片法与发酵法的对比试验结果分析[J].中国卫生检验杂志，2007,17(7):1300-1301.

[3]唐漪灵,郭奕芳,吴翊,沈蕾.Petrifilm纸片法和国标法检测奶制品细菌总数和大肠菌群数的结果比较[J].中国卫生检验杂志，2000,10(3):325-327.

[4]国家药典委员会.《中国药典》(2010版).北京：中国医药科技出版社，2010.

Comparison and application of microbial four-parameter detector and multi tube method.

Gao Xingang,Zhang Fang

(Qingdao Jiaming Measurement and Control Tech.Co.Ltd.,Qingdao 266000,China)

The compared results showed that the detector had a good correlation with the multiple tubes fermentation method.The determination was rapid (total coliforms ≤12h and total bacteria ≤18h).It can replace the tubes fermentation method to detect the four microbial indicators in water.

microorganisms in the water;total bacteria;detector;rapid determination

项目：国家重大科学仪器设备开发专项(2013YQ060721)

高心岗，男，1968年出生，本科，高级工程师，长年从事环保在线监测仪器开发工作，Email：13006525021@163.com。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.04.014

2015-12-23