拟南芥RabA2b互作蛋白的筛选与鉴定

冷琳娜，蒋建军，张　弛，王学路,3，苏　伟

(1. 复旦大学 生命科学学院 植物科学研究所,上海 200438；2. 复旦大学 遗传工程国家重点实验室,上海 200438；3. 华中农业大学 生命科学技术学院,武汉 430070)



拟南芥RabA2b互作蛋白的筛选与鉴定

冷琳娜1,2，蒋建军1,2，张弛1,2，王学路1,2,3，苏伟1,2

(1. 复旦大学 生命科学学院 植物科学研究所,上海 200438；2. 复旦大学 遗传工程国家重点实验室,上海 200438；3. 华中农业大学 生命科学技术学院,武汉 430070)

Rab蛋白家族在调控细胞囊泡的运输过程中发挥着重要作用.拟南芥中存在数量庞大的RabA亚族成员，它们参与调控植物不同阶段的生长发育过程.为了寻找拟南芥RabA亚族下游的调节蛋白或效应蛋白，进而阐明RabA在细胞活动中的角色，本研究选取RabA2b蛋白进行了深入研究.本研究首先构建过表达RabA2b的拟南芥植株，同时结合免疫共沉淀方法和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)检测到多个Hsp70蛋白家族成员与RabA2b蛋白共沉淀.为了进一步研究Hsp70成员与RabA2b的相互关系，将5个细胞质和细胞核定位的Hsp70s蛋白分别构建于植物表达载体，通过在烟草叶表皮细胞中瞬时表达Hsp70s和RabA2b发现它们共定位于细胞质膜、细胞质以及细胞核周围的丝状结构.同时，体外pull-down实验证明了5个Hsp70s蛋白都能与RabA2b蛋白直接相互作用.此外，双分子荧光互补实验(BiFC)进一步证实了Hsp70s与RabA2b在烟草叶表皮细胞中的相互作用，说明拟南芥中细胞质和细胞核定位的Hsp70s可以作为RabA2b的调节蛋白或效应蛋白一同调控植物的生长发育过程.

RabA2b； Hsp70； 相互作用； 调节蛋白或效应蛋白

Rab蛋白家族属于小G蛋白超家族[1]，小G蛋白是一类在细胞增殖、细胞骨架组装和细胞囊泡运输等多种过程[2]中发挥重要作用的分子.Rab蛋白家族成员在不同的物种之间数量差异巨大，裂殖酵母(S.pombe)中只有7个Rab蛋白.黑腹果蝇(D.melanogaster)和线虫(C.elegans)分别有26个和29个Rab蛋白.相比较而言，拟南芥(A.thaliana)和人类(H.sapiens)含有较多的Rab蛋白，分别为57个和60个[3-4].可以看出，随着生物体复杂性的增加，Rab蛋白家族成员也随之增多，这可能是出于细胞功能特化和精细调控的需求[5].尽管数量差异巨大，Rab家族成员在不同的物种中却非常保守，它们都在细胞质囊泡运输的不同阶段发挥重要作用，并且都是通过结合GTP的活性形式与结合GDP的非活性形式之间的转换来实现的[6].它们在不同物种中的功能差异可能是因为下游帮助其发挥功能的调节蛋白或效应蛋白不同.

在拟南芥中，根据种系发生关系，57个Rab蛋白被分为RabA～RabH 8个亚族[2]，进一步根据氨基酸序列的相似性和保守性，每个亚族被分为不同的子类，最终拟南芥中的Rab蛋白被分为了18个子类，各子类成员之间具有更相近的生物学功能、亚细胞定位以及系统发生关系.RabA2b属于RabA亚族，这个亚族十分庞大，拥有26个成员，占据了整个Rab家族的近一半，然而在酿酒酵母(S.cerevisiae)中，只有Ypt31/Ypt32与之对应[5]，由此可见拟南芥中特异存在的RabA亚族在拟南芥生长发育过程中发挥了特定且必需的功能.研究发现RabA亚族中的RabA2和RabA3子类蛋白主要定位在后高尔基体(post-Golgi)的一种新结构域上，同时参与了囊泡从反面高尔基体(trans-Golgi compartment)到细胞质膜的运输，并且调控了细胞板的生成[6].RabA亚族成员在调控花粉管的形态、花粉管的伸长、根毛的扩张、细胞壁的组分等方面发挥了重要的作用[7-10].除此之外，RabA亚族成员在响应外界环境的生物胁迫[11]与非生物胁迫[12]方面也发挥着重要的功能.但是目前在拟南芥中，对于RabA亚族成员的研究仅仅是通过与各种细胞器标记蛋白进行共定位实验以及研究负显性突变体(dominant negative mutant)的表型来描述它们在植物体中所发挥的功能，而关于它们的作用机制还知之甚少.为此，寻找RabA亚族的调节蛋白或效应蛋白能够为阐明其功能背后的分子机制奠定良好的基础.

热激蛋白(Heat Shock Protein， Hsp)是一类受外界环境条件尤其是高温诱导的蛋白，它们在生物体应对热和其他环境胁迫方面发挥着极其重要的作用[13-14].热激蛋白根据其相对分子质量的不同可以分为Hsp110、Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40和小分子热激蛋白(small Hsp).其中，Hsp70是一类在原核生物和真核生物中高度保守的分子伴侣蛋白[15].通过与ATP和ADP结合的两种状态的Hsp70之间的相互转换[16]以及辅助蛋白的协助[17-18]，Hsp70能够促进细胞新合成蛋白质的折叠、组装，变性蛋白的重新折叠、组装，蛋白聚集体的降解[19-20]以及前体蛋白的转运[21].

在拟南芥中至少有17个Hsp70蛋白家族成员，其中包含了13个DnaK亚族成员和4个Hsp110/SSE亚族成员.根据蛋白质序列分析可以把DnaK亚族成员分为4个子类.Hsp70-1至Hsp70-5(也称为Hsc70-1至Hsc70-3、Hsp70、Hsp70b)被预测定位在细胞质和细胞核中，Hsp70-6至Hsp70-8(也称为cpHsp70s)定位于质体中，Hsp70-9和Hsp70-10(也称为mtHsp70s)定位在线粒体中，Hsp70-11至Hsp70-13位于内质网中(也称为BiPs)[22-23].在拟南芥中，通过RNA干扰、过表达等技术手段发现Hsp70蛋白家族成员能够影响植株的生长发育进程、植株形态和对外界环境的生物与非生物胁迫的响应[24-26].除此之外，Hsp70蛋白在调控前体蛋白的降解[27]、细胞分裂过程[24]以及胚胎发育过程[27]中也发挥了重要的作用.

在拟南芥中，相对于RabA的其他子类来说，RabA2的研究较多，我们选取RabA2子类中的RabA2b作为研究对象来筛选和鉴定它可能存在的调节蛋白或效应蛋白.

1　材料与方法

1.1材料与试剂

拟南芥(Arabidopsisthaliana)： Col-0，烟草(Nicotianabenthamiana)，转Hsp70-1-GFP、Hsp70-2-GFP、Hsp70-3-GFP、Hsp70-4-GFP、Hsp70-5-GFP、RabA2b-FLAG基因拟南芥，大肠杆菌克隆菌株EscherichiacoliDH5α，大肠杆菌表达菌株E.coliTransetta，根瘤农杆菌菌株AgrobacteriumtumefaciensGV3101，烟草瞬时表达载体pCAMBIA-1302、pCAMBIA-mCherry、pXY104和pXY106，大肠杆菌蛋白表达载体pMAL-c2X和pET-42a，这些材料均由本实验室保存.

植物生长培养基(1/2MS培养基)： 2.2g/L MS粉，0.8%琼脂粉，pH5.6～6.0，向其中添加潮霉素用于抗性筛选.大肠杆菌和农杆菌完全培养基LB： 1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%氯化钠，向其中添加100μg/mL卡那霉素或100μg/mL氨苄青霉素或100μg/mL大观霉素或50μg/mL庆大霉素或25μg/mL 利福平用于抗性筛选.细菌培养基中加入1%琼脂粉即配制成相应的固体培养基.

1.2方法

1.2.1植物材料和生长条件

将干燥的拟南芥种子用75%(体积比)的酒精表面灭菌10min之后换用100%的酒精浸泡10min，播种于1/2MS固体培养基中，4℃春化3d后，置于长日照条件下培养(23℃，16h光照/8h黑暗).本研究中，用于液相色谱-串联质谱法的植物材料为在长日照条件下培养10d的植物幼苗.用于观察拟南芥根尖细胞中Hsp70-1、Hsp70-2、Hsp70-3、Hsp70-4、Hsp70-5亚细胞定位的植物材料为长日照条件下竖直培养5d的植物幼苗，用于BiFC实验的烟草植株在长光照条件下培养(28℃，16h光照/8h黑暗).

1.2.2免疫共沉淀实验

取生长10d大约2g的35S∶∶RabA2b-FLAG幼苗，用液氮进行充分研磨后，加入等体积的植物蛋白提取缓冲液(Tris-HCI pH7.5 100mmol/L,NaCl 300mmol/L,EDTA 2mmol/L,Glycerol 10%, Triton X-100 1%)和适量蛋白酶抑制剂，振荡混匀后，在静音混合器上4℃孵育1h，12000r/min 4℃离心10min，取上清，重复离心1次，移取上清至装有适量已经用植物蛋白提取缓冲液预先洗过3遍的FLAG树脂(Sigma)的EP管中，在静音混合器上4℃孵育3h, 2000r/min 4℃离心2min，去上清，用植物蛋白提取缓冲液清洗5遍，加等量2×蛋白上样缓冲液，95℃ 10min, 12000r/min离心2min,取100μL 上清液进行SDS-PAGE电泳，待蛋白预染maker中代表175kDa的条带刚刚进入分离胶时切下溴酚蓝上面的胶块送样至复旦大学遗传工程国家重点实验室生物化学平台进行液相色谱-串联质谱分析.

1.2.3基因和氨基酸序列分析

在TAIR网站(http：∥www.arabidopsis.org/)上查找相关基因序列和蛋白质氨基酸序列.用Clustal X2.1软件进行Hsp70-1到Hsp70-5的氨基酸序列比对.用MEGA 4.1软件构建系统进化树.

1.2.4蛋白质共定位实验及BiFC实验

将构建好的植物表达载体pXY104-Hsp70-1至pXY104-Hsp70-5、pXY106-RabA2b、空载体pXY104和pXY106、pCAMBIA-1302-Hsp70-1至pCAMBIA-1302-Hsp70-5、pCAMBIA-mCherry-RabA2b分别转化农杆菌GV3101，扩大培养相应的农杆菌，收获菌体.用烟草转化缓冲液将菌体悬起后分组混合至每种农杆菌的OD600=1时注射到烟草叶片中，黑暗培养16h后，在长日照条件下生长2d，用Leica SP8荧光共聚焦显微镜观察相应的荧光信号.

1.2.5MBP-RabA2b与GST-Hsp70-1至GST-Hsp70-5重组蛋白的体外表达及纯化

将构建好的原核表达载体pET-42a-Hsp70-1、pET-42a-Hsp70-2、pET-42a-Hsp70-3、pET-42a-Hsp70-4、pET-42a-Hsp70-5、pMAL-c2X-RabA2b和空载体pMAL-c2X分别转化至E.coliTransetta菌株中，37℃过夜培养相应的大肠杆菌表达菌株约4mL，然后扩大培养至OD600约为1时，加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L进行诱导，25℃培养5h收集菌体.向菌体中加入与融合标签对应的适量的蛋白结合缓冲液，加入溶菌酶至终浓度为1mg/mL，每隔5min振荡一次，其余时间置于冰上以保证低温环境，振荡悬浮充分后超声破碎10min，超声条件为超4s停10s.超声破碎结束后，12000r/min 4℃离心10min，取上清，重复离心1次，分别移取上清至装有已经用结合缓冲液预先清洗3次的GST树脂(购买于金斯瑞生物科技有限公司)和MBP树脂(购买于纽英伦生物技术有限公司)的EP管中，在静音混合器中4℃孵育3h，2000r/min 4℃离心2min，去上清，用蛋白结合缓冲液清洗珠子5～6遍，去上清.分别加入与标签蛋白相对应的洗脱缓冲液300μL，在静音混合器中4℃孵育30min，2000r/min 4℃离心2min，取上清分装后在-80℃保存.

1.2.6体外Pull-down实验

将纯化好的适量等量的GST-Hsp70-1至GST-Hsp70-5融合蛋白分别加入分装有预先用蛋白结合缓冲液清洗3遍的GST树脂的EP管中，在静音混合器中4℃孵育2h，2000r/min 4℃离心2min，去上清，用蛋白结合缓冲液清洗2遍，分别加入适量的MBP-RabA2b融合蛋白以及适当过量的MBP蛋白，4℃ 孵育2h，2000r/min 4℃离心2min，去上清，用蛋白结合缓冲液洗6～8遍，加入适量的5×蛋白上样缓冲液，95℃ 10min，12000r/min离心2min，取适量上清液进行SDS-PAGE电泳，在Western blot之后分别用MBP抗体和GST抗体检测MBP标签信号的存在和样品的上样量.

2　结果与分析

2.1RabA2b相互作用蛋白Hsp70s的发现

为了找到拟南芥RabA亚族下游的调节蛋白或效应蛋白，我们选取RabA2b蛋白进行相互作用研究.首先，我们构建了带有FLAG标签的过表达RabA2b拟南芥株系，使用FLAG树脂沉淀植物材料中的RabA2b蛋白及其复合物，并通过LC-MS/MS分析与RabA2b相互作用的蛋白序列，结果如表1和图1(见第474页)所示.

表1　LC-MS/MS获得的RabA2b相互作用蛋白Hsp70s

质谱分析结果表明与RabA2b共沉淀的蛋白包括了多个Hsp70家族成员，其中Hsp70-1与Hsp70-2的得分分别为500.03和265.65.除了细胞质和细胞核定位的Hsp70家族成员Hsp70-1和Hsp70-2以外，内质网驻留Hsp70蛋白BiP1、BiP2以及叶绿体热激蛋白cpHsp70-2也有较高得分，分别为156.54、192.52和77.81.据此，我们推测Hsp70蛋白家族成员可能与RabA2b相互作用，它们可能协助RabA2b蛋白发挥生物学功能.

2.2Hsp70s在拟南芥根尖细胞中的亚细胞定位

Chow等在2008年已经报道RabA2b主要分布在细胞质中靠近高尔基体(Golgi stacks)和液泡前体(prevacuolar compartments)，但不同于高尔基体与液泡前体并且与反式高尔基体(trans-Golgi compartment)部分重叠的一种新的结构中，他们把这种结构命名为Rab-A2/A3体(Rab-A2/A3 compartment)[6].因为互作蛋白应该具有相似的空间分布，所以我们推测细胞质和细胞核定位的Hsp70家族成员Hsp70-1和Hsp70-2最有可能与RabA2b相互作用从而调控RabA2b的功能.在TAIR网站搜索与Hsp70-1和Hsp70-2氨基酸序列相似性高的蛋白质序列，发现了另外3个细胞质和细胞核定位Hsp70s蛋白，即Hsp70-3、Hsp70-4、Hsp70-5.使用Clustal X2.1软件比对Hsp70-1至Hsp70-5的氨基酸序列，结果表明任意两个预测在细胞质和细胞核定位的Hsp70s的氨基酸序列相似性都大于80%(图2(a))；使用MEGA 4.1软件构建系统进化树，表明5个Hsp70s具有很近的系统进化关系(图2(b)).由此，我们在接下来的研究中详细研究了这5个Hsp70s蛋白与RabA2b的相互作用关系.

(a)

为了验证这一类Hsp70s蛋白确实定位于细胞质和细胞核中，我们首先构建了过表达35S∶∶Hsp70s-GFP的拟南芥转基因植株，使用Leica SP8荧光共聚焦显微镜观察在长日照条件下培养5d的转基因幼苗的根尖细胞，5个Hsp70s蛋白都广泛地分布于细胞质，细胞质膜和细胞核中(图3),与预测[26]和已有文献报道[25,28]的细胞质和细胞核定位相一致.同时Hsp70s蛋白的定位与文献报道[6]的RabA2b蛋白的定位重叠.为了进一步验证Hsp70s与RabA2b是否真正具有相似的空间定位，我们接下来在烟草叶表皮细胞中进行了Hsp70s和RabA2b的共定位实验.

2.3Hsp70s分别与RabA2b在烟草叶表皮细胞中共定位

为了进一步验证Hsp70s与RabA2b是否在细胞的相同部位发挥作用，我们分别构建了红色荧光蛋白mCherry与RabA2b的C端融合的植物表达载体RabA2b-mCherry和绿色荧光蛋白GFP与Hsp70s的C端融合的植物表达载体Hsp70s-GFP.将植物表达载体分别转入农杆菌GV3101后，再共同转化烟草叶表皮细胞，暗培养16h，在长日照条件下再培养2d，取注射过农杆菌的烟草叶片在荧光共聚焦显微镜下观察.结果表明在烟草叶表皮细胞中5个Hsp70s-GFP的荧光信号在细胞质、细胞核和细胞质膜中都有分布(图4A1～A5，见第476页)，这与拟南芥根尖稳定表达Hsp70s-GFP蛋白的结果相一致.除此以外，发现Hsp70s-GFP也定位于细胞核周围的丝状结构上，根据文献报道[29-30]我们初步推测细胞核周围的丝状结构为内质网结构，准确的结论还需要用内质网的标记蛋白进行进一步的共定位实验分析.另一方面，在细胞质膜、细胞质以及细胞核周围的丝状结构上也检测到RabA2b-mCherry的荧光信号(图4B1～B5)，这与Hsp70s-GFP的定位十分一致.通过叠加Hsp70s-GFP的绿色荧光信号和RabA2b-mCherry的红色荧光信号，我们发现Hsp70s与RabA2b蛋白共同定位于细胞质膜、细胞质以及细胞核周围的丝状结构上(图4D1～D5).由此可知，RabA2b与Hsp70s在细胞水平上具有相互作用的空间基础，这为证实Hsp70s为RabA2b的调节蛋白或效应蛋白提供了进一步的细胞生物学证据.

2.4Pull-down实验证明RabA2b与Hsp70s在体外相互作用

将RabA2b的编码序列克隆到pMAL-c2X原核表达载体上，Hsp70s的编码序列分别构建到pET-42a载体上.将构建好的原核表达载体以及空载体分别转入E.coliTransetta菌株中进行诱导表达，纯化后得到蛋白MBP-RabA2b、MBP以及GST-Hsp70s，其中MBP和GST-Hsp70s的组合作为阴性对照.将5个重组蛋白GST-Hsp70s分别与GST树脂结合后，加入适量的MBP-RabA2b和适当过量的MBP蛋白共同孵育，再洗去非特异性结合的蛋白.在Western blot之后，使用MBP抗体检测洗脱液中的MBP标签信号，结果表明GST-Hsp70-1、GST-Hsp70-2、GST-Hsp70-3、GST-Hsp70-4、GST-Hsp70-5与MBP-RabA2b共孵育的洗脱液中都获得了强的杂交信号，而在与MBP蛋白共孵育的样品中只检测到极微弱的杂交信号(图5)，从而表明RabA2b在体外能够特异地和5个GST-Hsp70s蛋白发生直接的物理相互作用.此结果既为Hsp70s蛋白是RabA2b可能的调节蛋白或效应蛋白提供了分子生物学方面的证据，也证实了前期免疫共沉淀实验和LC-MS/MS的准确性和可靠性.

2.5RabA2b分别与Hsp70s在烟草叶表皮细胞中相互作用

我们进一步利用双分子荧光互补实验探究RabA2b与Hsp70s在植物体中是否也存在相互作用.我们首先构建了与黄色荧光蛋白(YFP)的N端融合的RabA2b植物表达载体pXY106-RabA2b和与YFP羧基端融合的Hsp70-1至Hsp70-5植物表达载体pXY104-Hsp70-1至pXY104-Hsp70-5.将构建好的植物表达载体以及空载体pXY106、pXY104分别转入农杆菌GV3101中，然后两两混合共同转入烟草叶表皮细胞中，经黑暗培养16h、长日照条件下再培养2d后，蛋白在烟草叶片中瞬时表达，通过Leica SP8荧光共聚焦显微镜观察到pXY106-RabA2b分别与pXY104-Hsp70s共转的烟草叶表皮细胞中出现非常强的不规则颗粒状荧光信号(图6A1～A5)，而与空载体配对的蛋白组合没有检测到任何荧光信号(图6A6～A12)，说明在烟草叶片中RabA2b和5个Hsp70s都能相互作用.

为了确定荧光信号在细胞中的具体定位，我们把烟草叶表皮细胞用DAPI(一种细胞核染料)染色(图6B1～B12).显微镜观察结果表明DAPI染色后细胞核发出的蓝紫色荧光信号与相互作用信号并没有重叠(图6D1～D5)，也就是说RabA2b和5个Hsp70s的相互作用不是发生在细胞核中.但是，关于它们发生相互作用具体位于细胞质中的哪种结构还需要使用带有荧光标记的各种细胞器的标签蛋白进行进一步的共定位实验来证明.

3　讨　论

在哺乳动物和酵母当中，Rab家族成员的调节蛋白和效应蛋白的筛选鉴定工作已经取得了很大进展.这些调节蛋白和效应蛋白主要包括肌球蛋白、驱动蛋白、磷脂酰肌醇代谢相关的酶以及与囊泡出芽和融合有关的调节因子[31-33].但是在植物当中，被筛选鉴定出的Rab调节蛋白和效应蛋白非常有限，并且由于Rab调节蛋白和效应蛋白的结构异质性造成了我们不能简单地通过不同物种间的蛋白序列比对找出植物中对应的Rab调节蛋白和效应蛋白.在已有的与植物Rab蛋白相关的报道中，通过酵母双杂交实验、共定位实验以及Pull-down实验，PI-4Kβ1已经被证明是RabA4b[34]和RabA4d[7]的共同效应蛋白，PI-4Kβ1分别与RabA4b和RabA4d参与调控了拟南芥根毛的极性扩张以及花粉管尖端的生长过程.除此之外，在番茄中，Rab11特异性地参与了SYP122依赖的囊泡运输过程[35]，但是SYP122是否为Rab11的调节或效应蛋白还需要进一步的实验进行验证.在gnom突变体细胞当中，RabF2的分布发生了变化，暗示GNOM对于RabF2的定位有重要的作用[36]，但是至今还没有直接的证据表明GNOM蛋白是RabF2的调节蛋白或效应蛋白.本研究中我们通过体外Pull-down和BiFC实验分别证明了RabA2b能够和5个细胞质和细胞核定位的Hsp70s蛋白在植物体外和植物体内发生相互作用，为进一步证实Hsp70s为RabA2b可能的调节蛋白或效应蛋白提供了分子生物学证据，同时也为进一步阐明RabA2b在拟南芥中参与调控的生物学过程奠定了细胞学层面的基础.

Cazale等研究发现在拟南芥中过表达Hsp70-1使植株的根变短，并且证明根尖分生区细胞的长度并没有明显变化，造成短根表型的主要原因是突变体主根细胞数目的减少[24].也有研究通过RNA干扰技术在Hsc70-1的T-DNA插入突变体背景下抑制Hsc70-4基因的表达，发现转基因植株的细胞分裂不正常，产生了只有单片子叶、两片子叶不对称或者两片子叶发生融合的畸形植株[27].另一方面，对于RabA2子类成员的研究表明该子类成员主要分布在细胞板特别是细胞板延伸的边缘，RabA2a负显性突变体的根生长畸形，通过显微镜观察发现该突变体大多数根细胞含有多个细胞核，这种现象是由于细胞进行了连续的有丝分裂但却没有进行彻底的胞质分裂造成的[6].因此，在拟南芥中细胞质和细胞核定位的Hsp70s和调控囊泡从反面高尔基体到细胞质膜运输的RabA2子类成员在调控细胞分裂的过程中都发挥了极其重要的作用.在本研究中我们发现并证实了Hsp70s和RabA2b的相互作用关系.由此推测Hsp70s很可能和RabA2b蛋白一起参与了拟南芥根尖细胞的分裂过程，这将是我们今后研究的重点.

对于拟南芥花粉管发育的研究表明RabA亚族成员RabA4d特异性地定位在花粉管，RabA4d的突变体表现出膨胀的花粉管，花粉管的生长速率减慢同时花粉管细胞壁的组分发生了改变[7].另有研究发现编码Hsp70辅助蛋白AtJ1的基因插入失活导致开花延迟同时结实率降低[37].而且通过比较干燥的成熟花粉粒、吸水之后的花粉粒以及正在伸长的花粉管的转录组数据发现在花粉萌发和花粉管伸长的过程中都有大量的Hsp基因在转录水平上上调[38].这预示着Hsp70s可能与RabA亚族成员在花粉管的伸长过程中发挥重要作用，最终影响植物的结实率.

在植物抵御病原菌的入侵方面有研究发现AtHsp70-15缺失突变体对芜菁花叶病毒表现出更强的抗性[25].同时实验证明RabA6a和RabA4c在FLS2内吞过程的不同阶段发挥作用[11].分布在细胞质膜上的FLS2是细菌鞭毛蛋白的受体蛋白，它在识别了细菌入侵信号之后，能将信号传递到细胞内部从而启动一系列的反应来抵御病原菌的入侵.因此，Hsp70s和RabA亚族成员在植物免疫方面的作用也应该引起重视.

在本研究过程中，无论是Hsp70s的亚细胞定位结果和Hsp70s与RabA2b的共定位结果还是Hsp70s与RabA2b的体外Pull-down结果和BiFC结果都证实了Hsp70s与RabA2b之间的相互作用，并且这种作用在细胞质和细胞核定位的5个Hsp70s蛋白间没有差异，说明了在拟南芥中这5个Hsp70基因在功能上是冗余的，同时也可以从侧面反映Hsp70s和RabA2b蛋白协同发挥了重要的生物学功能，5个Hsp70s蛋白共同与RabA2b相互作用为处于复杂生活环境中的植物体提供了多重保障.

但是Hsp70s是否是RabA2b真正的调节蛋白或效应蛋白与RabA2b共同参与调控细胞的分裂、花粉管的伸长、抵抗病原菌的入侵或者是植物体其他的生长发育过程，仅仅有亚细胞定位、共定位和蛋白质相互作用的实验证据是明显不够的，遗传学方面的证据也必不可少.如果我们能够构建RabA亚家族与Hsp70s的多突变体遗传材料，分析细胞的分裂、花粉管的伸长、抵抗病原菌的入侵等方面的遗传表型，就能最终确定Hsp70s是否是RabA2b的调节蛋白或效应蛋白参与调控了上述生命活动.但是对于本研究而言获取遗传学方面的证据非常困难，正如上文中分析的5个Hsp70s基因在功能上具有很强的冗余性，导致单基因的变化不会改变遗传表型.同时这类蛋白参与基础细胞生命活动，如果将多个Hsp70s基因同时突变，将造成植株死亡.另外，至今仍然没有发现针对Hsp70s家族成员特异的抑制剂[24]，所以在短时间内很难在遗传上获得证据分析证实Hsp70s与RabA2b相互作用的生物学意义.下一步，我们既要克服困难逐步构建RabA亚家族与Hsp70s的多突变体遗传材料，也要运用新的方法和技术研究在植物生长发育过程中Hsp70s与RabA2b相互作用的重要生物学意义.

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Identification and Characterization of RabA2b-interacting Proteins

LENG Linna1,2, JIANG Jianjun1,2, ZHANG Chi1,2, WANG Xuelu1,2,3, SU Wei1,2

(1.InstituteofPlantBiology,SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200438,China; 2.StateKeyLaboratoryofGeneticEngineering,FudanUniversity,Shanghai200438,China; 3.CollegeofLifeScienceandTechnology,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China)

The small G-protein Rab family members play significant roles in cellular trafficking processes. InArabidopsis, the most prominent characteristic of the Rab family is possessing numerous RabA subfamily members, which participate in regulating distinct growth and developmental processes. To elucidate the molecular mechanisms underlying the RabA subfamily, we used RabA2b as a research object to screen and identify the downstream regulatory or effector molecules. Initially, we constructed RabA2b overexpression plants, and then through co-immunoprecipitation assay and LC-MS/MS assay, we detected a number of Hsp70 family proteins interacting with RabA2b. In order to explore the concrete relationship between Hsp70 family and RabA2b, we constructed related plant expression vectors of 5 Hsp70s, namely Hsp70-1 to Hsp70-5, as well as RabA2b, respectively. The results from co-localization assay showed that Hsp70s and RabA2b were both located in cytoplasm and fibrillar structures and on the plasma membrane in pavement cells ofN.benthamiana. At the meantime,invitopull-down assay confirmed that Hsp70s could directly interact with RabA2b. Furthermore, bimolecular fluorescence complementation assay further provided the evidence that the interaction between Hsp70s and RabA2b existedinvivo. These results suggest that Hsp70s serve as the regulatory or effector proteins of RabA2b to synergistically regulate the diverse growth and developmental processes inArabidopsis.

RabA2b; Hsp70; interaction; regulatory or effector protein

0427-7104(2016)04-0471-11

2015-12-09

国家自然科学基金面上项目(KRH1322423)

冷琳娜(1992—)，女，硕士研究生；苏伟，女，副教授，通讯联系人，E-mail: weisu@fudan.edu.cn.

Q 37

A