DEHP、MEHP对小鼠胚胎干细胞细胞毒性的研究

李玉秋，段志文，裴秀丛，张玉敏，马明月



·论著·

DEHP、MEHP对小鼠胚胎干细胞细胞毒性的研究

李玉秋，段志文，裴秀丛，张玉敏，马明月*

目的分析不同浓度的邻苯二甲酸二乙基己酯[di (2-ethylhexyl) phthalate，DEHP] 及其活性代谢产物邻苯二甲酸单乙基己基酯[mono (2-ethylhexyl) phthalate，MEHP)对小鼠胚胎干细胞细胞毒性、增殖的影响。方法用含有不同浓度DEHP (1 000、100、10、1、0.1、0.01 μmol/L)、MEHP (1 000、100、10、1、0.1、0.01 μmol/L)的培养液，对胚胎干细胞进行培养，用CCK-8法检测细胞活性。结果染毒96 h后，高剂量(1 000 μmol/L) DEHP、MEHP均对胚胎干细胞的增殖有抑制作用(P<0.05)，且染毒剂量与细胞抑制率之间存在明显的正相关性，相关系数分别为0.51、0.62 (P<0.05)。结论在一定浓度范围内，DEHP及MEHP均对小鼠ESC具有细胞毒性，且有浓度依赖性。

DEHP；MEHP；小鼠胚胎干细胞；细胞毒性

0　引言

邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯[di (2-ethylhexyl) phthalate，DEHP]作为可塑剂，全球年产量达300～400万吨[1]，广泛应用于包装材料、医疗用品、儿童玩具以及化妆品等制造行业[2]。DEHP仅依靠分子间的作用力，而非化学键实现与塑料主体基质的结合，因此可以不断地从塑料制品中游离出来[3]，污染空气、土壤、水源甚至食物。可经消化道、肺和皮肤吸收进入人体，以消化道吸收为主。另外，DEHP还可以通过输液、透析等途径直接进入血液[4]；甚至能通过胎盘屏障直接作用于胎儿，影响胎儿发育[5]。DEHP在进入机体后，经酶作用水解为活性代谢产物邻苯二甲酸单乙基己基酯[Mono(2-ethylhexyl) phthalate，MEHP]而被吸收，威胁人类的健康。随着干细胞研究的发展，具有无限增殖、自我更新特性[6]的胚胎干细胞(Embryonic stem cell，ESC)，因其能灵敏、准确地评价毒物的毒性作用，而被广泛应用于各种研究中。本研究使用不同浓度的DEHP及其活性代谢产物MEHP培养小鼠ESC，研究DEHP和MEHP对小鼠ESC的细胞毒性。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1细胞小鼠ESC M1细胞系、小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryo fibroblasts，MEF) (C57/BL6，P3 辐照后)均购自中国上海斯丹赛生物技术有限公司。

1.1.2仪器和试剂SeriesII 3 110 CO2培养箱(美国Thermo公司)、超净工作台(中国北京东联哈尔仪器制造有限公司)、倒置显微镜(中国北京欣惠泽奥科技有限公司)、ST 16离心机(德国Thermo公司)、酶标仪(美国Molecular Device公司)。DEHP(纯度：99%，美国Sigma公司)；MEHP(纯度：98%，美国Pharmachem公司)；小鼠ES细胞完全培养基、小鼠ES细胞分化培养基、AP染色液试剂盒(中国上海斯丹赛生物技术有限公司)；基础培养基(DMEM/F12，美国HyClone)；胎牛血清(美国Biochrom)；青霉素-链霉素(美国Biological Industries公司)；二甲基亚砜(美国Sigma公司)；明胶(美国Sigma公司)；CCK-8 细胞活性试剂盒(日本Dojindo公司)。

1.2方法

1.2.1小鼠ESC的复苏与培养T25培养瓶中加入1 mL明胶，使其平铺培养瓶底，37 ℃、5%CO2温箱中培养20 min以上，吸弃明胶，加4 mL含10%FBS的MEF培养基备用。从液氮中取出MEF细胞冻存管，37 ℃水浴锅中快速解冻并不断摇动。冻存管消毒后，将全部的细胞悬液移入之前备好的培养瓶中。放于37 ℃、5%CO2温箱培养2 d，制成滋养层细胞。滋养层细胞长成熟后，将培养液吸弃，用1 mL小鼠ESC完全培养液清洗1遍，快速复苏小鼠ESC并种入(方法如前)，补加小鼠ESC完全培养液至4 mL，在37 ℃、5%CO2温箱培养。每天换液，培养5～7 d，ESC可进行传代。

1.2.2小鼠ESC的鉴定显微镜观察ESC的生长及形态特征。

碱性磷酸酶(AP)染色：①吸出细胞培养液，用PBS润洗2～3次；②用4%多聚甲醛固定1～2 min，吸出固定液，用PBS洗2次；③吸出PBS，用TBST润洗2次；④准备碱性磷酸酶试剂：溶液A(白瓶盖)∶溶液B(绿瓶盖)∶溶液C=50 μL∶12.5 μL∶437.5 μL；⑤吸弃TBST溶液；⑥加入足量的染色试剂使染色液能足够覆盖孔底，室温避光放置15～20 min；⑦吸出染色液，用PBS缓冲液润洗1次，最后保存于PBS溶液中，显微镜下观察染色结果(未分化细胞染色为蓝/紫色，分化的细胞染色为无色)。

1.2.3DEHP、MEHP的配制将DEHP、MEHP分别溶解于DMSO中，用小鼠ESC分化培养基稀释得到浓度为10 000 μmol/L的母液(DMSO含量为1%)。之后分别稀释出含DEHP、MEHP浓度为1 000、100、10、1、0.1 μmol/L的培养液。同时用小鼠ESC分化培养基配置含1% DMSO的培养液作为对照。

1.2.4小鼠ESC细胞活性检测用0.25%胰酶将处于对数生长期的小鼠ESC消化，收集细胞。用小鼠ESC分化培养基将细胞稀释为10×104个/mL，以100 μL/孔种于96孔板中。温箱培养24 h贴壁后，将含不同浓度DEHP、MEHP及1% DMSO的培养液以10 μL/孔加入到96孔板中，每个剂量设3个复孔。温箱培养96 h后，加入CCK8 (10 μL/孔)，温箱继续培养3 h，于酶标仪450 nm波长处测吸光度OD值。第3天换液。

2　结果

2.1小鼠ESC的鉴定在倒置显微镜观察下，小鼠ESC在MEF为支持的滋养层细胞上呈克隆生长，边缘清晰，细胞聚集紧密，如图1。将处于对数生长期的ESC，用碱性磷酸酶(AP)染色试剂盒染色，未分化的ESC呈蓝紫色细胞团，而分化的细胞未着色，见图2。

图1　小鼠ESC、MEF细胞生长状况

图2　小鼠ESC的碱性磷酸酶染色

2.2DEHP、MEHP对小鼠ESC增殖的影响与对照组相比，DEHP、MEHP对小鼠ESC染毒96 h后，高剂量(1 000 μmol/L)组的吸光度值均显著下降(P<0.05)，见表1。细胞抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。高剂量(1 000 μmol/L)的DEHP、MEHP对小鼠ESC抑制作用明显增强(P<0.05)，见表1。

表1　DEHP、MEHP对小鼠ESC细胞增殖及细胞抑制率的影响(n=3)

注：*与对照组比较，P<0.05

2.3不同浓度DEHP、MEHP对小鼠ESC细胞活性抑制作用的相关性DEHP、MEHP的染毒剂量与小鼠ESC受到的抑制作用呈显著的正相关性，相关系数分别为0.51、0.62 (P<0.05)，见表2。即随着染毒剂量的增加，DEHP、MEHP对小鼠ESC活性的抑制作用增强，存在明显的剂量依存关系。

表2　不同浓度DEHP、MEHP与小鼠ESC细胞抑制率的相关性

3　讨论

ESC是指受精卵分裂发育成囊胚时，从内细胞团(Inner cell mass)[7]分离出的细胞，具有无限增殖、自我更新的特性，无论是在体内还是体外环境，都能被诱导分化为机体几乎所有类型的细胞[6]。由于ESC具有全能性，且在体外连续传代并保持未分化状态，以及对受试物作用反应迅速、敏感性高、干扰因素少等优点[8]，是较好的体外替代试验的生物材料。

自1981年Evans等[9]首次发现并分离小鼠ESC，1998年Thomson等[10]成功分离人类ESC，研究者们已经进行了大量的ESC研究，并且成功地建立了大鼠、小鼠、灵长类等多种动物的ESC细胞系[11]。这些细胞系中，小鼠、猴和人类的ESC细胞系可以在体外长期增殖并保持未分化状态[12]，其中小鼠ESC体外分离培养更为简单易行[13]，其培养方法也较为完善。Evans等[9]以STO细胞作为饲养层，Wobus等[14]以小鼠原代胚胎成纤维细胞(Primary embryonic fibroblast，pMEF)为分化抑制物，Nihcol等[15]在培养基中添加LIF作为分化抑制剂，由此可见，目前小鼠ESC培养技术已经基本成熟，并得到了广泛应用。

DEHP是具有第2类生殖毒性的邻苯二甲酸酯类物质，已被列入优先控制的污染物名单中[16]。其急性毒性较弱，但动物实验发现，DEHP及其代谢产物MEHP对发育中及成年动物的心、肝、肺、肾及生殖系统等多种组织系统均能产生广泛的慢性毒性作用，甚至具有致畸性、致突变性和致癌性[17]。Shi等[18]报道，高剂量(1 000 μmol/L)的MEHP能抑制人ESC细胞增殖，具有明显的细胞毒性。本研究发现，高剂量的DEHP、MEHP均能抑制小鼠ESC的细胞活性。Lim等[19]报道，1 000 μmol/L MEHP可使小鼠胚胎干细胞的细胞活性明显降低，与本研究结果一致。笔者研究发现，DEHP、MEHP的染毒剂量与细胞抑制率存在剂量依赖关系，与Janer等[20]关于MEHP对胚胎生长有浓度依赖性的研究结果一致。

本研究发现，高剂量的DEHP、MEHP均能抑制小鼠ESC的活性，具有细胞毒性，且存在剂量依赖关系，但其作用机制还需进一步研究。

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Effect of DEHP and MEHP on the cytotoxicity of embryonic stem cell of mouse

LI Yu-qiu,DUAN Zhi-wen,PEI Xiu-cong,ZHANG Yu-min,MA Ming-yue*

(Department of Toxicology,School of Public Health,Shenyang Medical College,Shenyang 110034,China)

ObjectiveTo investigate the effect of di (2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) and mono (2-ethylhexyl) phthalate (MEHP) on the cytotoxicity of mouse embryonic stem cells (mESC).MethodsmESC was cultured in the culture media of DEHP (1 000,100,10,1,0.1,0.01 μmol/L) and MEHP (1 000,100,10,1,0.1,0.01 μmol/L).Cell viability was evaluated by CCK8.ResultsThe inhibition rate of 1 000 μmol/L of DEHP and MEHP on mESC after 96 h increased significantly (P<0.05).In addition,the inhibition rate was correlated with the concentration of DEHP and MEHP positively,the correlation coefficient being 0.51 and 0.62 respectively (P<0.05).ConclusionDEHP and MEHP both have dose-dependent cytotoxicity on mESC.

DEHP;MEHP;mESC;Cytotoxicity

2016-03-14

沈阳医学院公共卫生学院毒理学教研室，沈阳 110034

沈阳市科技局项目(F14-158-9-22)；辽宁省教育厅一般项目(L2014414)

10.14053/j.cnki.ppcr.201608001