应用间接ELISA方法检测马鼻疽抗体

谢柱彬，袁镜乐，殷进方，黄育浩，卢伟昌，张险朋（.东莞市东坑镇农业技术服务中心，广东 东莞 5960；.东莞市厚街镇农业技术服务中心，广东 东莞 5960；.东莞市动物疫病预防控制中心，广东 东莞 5086）

应用间接ELISA方法检测马鼻疽抗体

谢柱彬1，袁镜乐2，殷进方3，黄育浩3，卢伟昌1，张险朋3
（1.东莞市东坑镇农业技术服务中心，广东 东莞 523960；2.东莞市厚街镇农业技术服务中心，广东 东莞 523960；3.东莞市动物疫病预防控制中心，广东 东莞 523086）

为了验证间接ELISA方法检测马鼻疽抗体的可行性，在东莞市4个马场采集马血清，应用间接ELISA方法进行检测，同时对这些马匹进行鼻疽菌素滴眼反应检疫。结果为间接ELISA阳性对照血清和阴性对照血清结果均成立，采集51份马血清马鼻疽抗体均为阴性，鼻疽菌素滴眼反应检疫结果均为阴性。结果表明，应用间接ELISA方法检测马鼻疽抗体可行，东莞市的马匹未发现有马鼻疽的感染。

马鼻疽；间接ELISA；滴眼反应；马

马鼻疽是由鼻疽伯氏菌（Burkholderia mallei）所引起的马、驴和骡等马属动物的一种接触性传染性致死性传染病，俗称“吊鼻”、“串槽”。该病主要发生在成年马匹的皮肤、淋巴系统和呼吸道系统，临床症状主要表现为在鼻腔或皮肤形成特异性的鼻疽结节、溃疡或在肺脏、淋巴结等脏器出现结节。病马是该病的主要传染源，主要通过被污染的饲料和饮水经消化道感染。病马和健康马之间互相接触，舔，咬病变部分泌物及污染的用具，也可被感染，潜伏期较长，数周到数月。OIE将该病列为B类病，我国农业部规定为二类动物疫病。1949年解放以后，该病曾在我国北方大范围暴发流行，给养马业带来巨大的损失，严重影响人类的健康，危害公共卫生安全。为了验证间接ELISA检测马鼻疽抗体的可行性，在东莞市采集了51份马血清进行检测，并用马鼻疽滴眼反应检疫结果相比较，现将试验结果报告如下。

1　材料与方法

1.1马血清

共51份，采自东莞市4个马场。颈静脉采血，以3500r/min离心15min分离获得待检血清，-20℃保存备检。

1.2试剂和仪器

马鼻疽抗体ELISA试剂盒：购自美国Bioo Scientific公司，批号为ss02102016。马鼻疽菌素：购自中国兽药监察所。SUNRISE酶标仪购自TECAN公司。

1.3间接ELISA方法

1.3.1使用前，所有的试剂组分回复到室温（21℃±5℃）至少1h，此试验为双孔试验，每个样品和对照都需做双孔。

1.3.2吸取100μL阳性对照到酶标板上，吸取100μL阴性对照到酶标板上；加入100μL 200倍稀释后的待检血清，封板室温孵育60min。

1.3.3倒掉板孔中的液体，每孔加250μL稀释后的洗涤液，浸泡1min，洗板6次，最后拍干。每孔加入100μL稀释后的酶标二抗，封板室温孵育30min。

1.3.4倒掉板孔中的液体，按照上述方法洗板6次，拍干。每孔加入100μL底物，封板室温孵育10min，加入100μL终止液，混匀后450nm读数。

1.3.5结果判定Cut off等于阴性对照平均OD值加上2倍阴性对照标准差，阳性对照的平均OD值大于CO值，结果成立。样品平均OD值大于CO值，马鼻疽抗体判为阳性，样品平均OD值小于CO值，马鼻疽抗体判为阴性。

1.4鼻疽菌素滴眼反应

马匹滴眼前仔细检查马匹眼睛，结膜正常才可滴眼，同时检查颌下淋巴结，皮肤及有无流鼻等，并详细记录。一般情况下滴左眼，左眼有问题可滴右眼，应记录。在左眼中滴入鼻疽菌素原液3～4滴。在滴眼后3、6、9h，共检查3次，在24h再检查一次。滴眼后无反应的马匹，或结膜微充血及流泪的马匹判为阴性；结膜潮红，轻度肿胀，分泌物为灰白色浆液性及粘液性的马匹判为可疑；结膜发炎，肿胀明显，分泌物为脓性的马匹判为阳性。

2　结　果

2.1间接ELISA检测结果

结果为阴性对照平均OD值为 0.2375，Cut off值为0.2875，阳性对照平均OD值为2.6245，间接ELISA结果成立。在检测的51份马血清中，结果均为阴性，阳性率为0，结果详见表1。

表1　东莞市马场马鼻疽抗体检测结果

2.2马鼻疽菌素滴眼反应检疫结果

在检疫的51匹马中，马鼻疽菌素滴眼反应检疫结果均为阴性，滴眼后在3，6，9，24h检查均未发现马匹眼睛有炎症反应。

3　讨　论

3.1东莞市马匹的存栏量为100多匹，主要用于赛马，休闲和娱乐，流动性比较大。东莞市按照“无马疫区的规定”每年采用鼻疽菌素滴眼反应进行检疫，多年来一直未发现有马鼻疽阳性反应。此次试验采用间接ELISA方法检测结果均为阴性，与鼻疽菌素滴眼反应检疫结果为一致。结果表明，我市的马匹未发现有马鼻疽的感染，说明马鼻疽疫情控制的很好。

3.2鼻疽菌素试验是国家规定检疫马鼻疽的方法，该方法一直用于大批马匹的检疫，但该检疫方法的时间长，需在3，6，9，24h到场进行检查，并受人为因素影响大。ELISA方法操作简单，时间短，结果准确，受人为因素干扰少，并且适合大规模的检测。对ELISA、CF、AGID和HA等方法进行比较的结果显示，ELISA与临床马鼻疽确诊病例符合率达到100%，而其他试验仅有90.9%的符合率，因此，ELISA能够作为马鼻疽常规采用的高灵敏度诊断方法。

3.3虽然我市在马鼻疽的防控做的比较好，但是马匹的流动性比较大，带来一定的隐患。我市马鼻疽的防控工作不能放松，按照《马鼻疽防治技术规范》每年做好马鼻疽的检疫。按照“广东从化无马疫区”的要求，定期对马场进行巡查，发现疑似病例及时上报，并及时派专业人员到现场处理。加强马场的饲养管理，做好消毒等防疫措施，提高马匹的抗病能力。异地调运马属动物，必须来自非疫区，并做好隔离，在隔离期内进行检疫，连续2次（间隔5～6d）鼻疽菌素试验检疫，确认健康无病，方可混群饲养。售马属动物的单位和个人，应在出售前按规定报检，经当地动物防疫监督机构检疫并签发产地检疫证后，方可调运。

［1］陆承平.兽医微生物学［M］.北京.中国农业出版社，2007：462-463.

［2］张亚黎，等.浅谈关于马鼻疽的诊断及防制措施［J］.中兽医杂志，2014，11：21.

［3］中国农业科学院哈尔滨兽医研究所.动物传染病学［M］.北京：中国农业出版社，1999，75-84.

［4］陈琦，等.马鼻疽研究进展［J］.中国兽医杂志，2012，48（11）：48-50.

10.3969/J.ISSN.1671-6027.2016.08.028

谢柱彬（1978～），广东省东莞市人，助理兽医师，从事动物疫病防控工作