禽坦布苏病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

万春和，陈翠腾，傅秋玲，程龙飞，傅光华，陈红梅，施少华，黄　瑜

(福建省农业科学院 畜牧兽医研究所 福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福建 福州 350013)



禽坦布苏病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

万春和，陈翠腾，傅秋玲，程龙飞，傅光华，陈红梅，施少华，黄瑜

(福建省农业科学院 畜牧兽医研究所 福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福建 福州 350013)

【目的】 建立禽坦布苏病毒(Avian Tembusu virus，ATmV)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。【方法】 根据ATmV非结构蛋白NS1的基因特征，设计特异性的引物和探针，建立基于TaqMan探针检测ATmV的实时荧光定量PCR检测方法，对其特异性、重复性进行检测。用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法和之前建立的RT-PCR方法同时对临床15份疑似ATmV感染的病料进行检测，计算其符合率。【结果】 成功建立了检测ATmV的实时荧光定量PCR检测方法，当NS1基因含量为(2.67×102)～(2.67×107) 拷贝/μL时有良好的线性扩增，其扩增相关系数为0.998，扩增效率为99.9%。建立的ATmV实时荧光定量PCR检测方法敏感度高，最低检测限为2.67×102拷贝/μL；特异性强，对水禽常见病毒(如Ⅰ型鸭肝炎病毒、新型鸭呼肠孤病毒、禽流感病毒、禽Ⅰ型副粘病毒与番鸭细小病毒等)检测均为阴性；重复性好，组内变异系数和组间变异系数分别为0.39%～1.17%和 0.51%～1.82%。对临床送检的15份病料，TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的阳性率为73.33%(11/15)，RT-PCR方法的阳性率为60.0%(9/15)，2种方法的符合率为100.0%。【结论】 建立了基于TaqMan探针的ATmV实时荧光定量PCR检测方法，该方法可应用于ATmV感染的早期检测。

禽坦布苏病毒；NS1基因；TaqMan；实时荧光定量PCR方法

自2010年春季以来，我国南方种(蛋)鸭养殖厂发生一种以产蛋率急剧下降甚至停产为典型特征的鸭新发传染病，临床剖检病变主要为卵巢发育不良，卵泡变性、出血或破裂。该病在不同地区、不同品种鸭群发病率高低不一，群内发病率几乎为100%，病死率为0～12%。国内多家科研单位开展联合攻关，鉴定该病为坦布苏病毒(Tembusu virus)感染所致[1-4],随后对坦布苏病毒开展了大量的流行病学调查，先后从鹅、蛋鸡、麻雀、鸽子和蚊子体内分离到该病原[5]。本研究团队结合坦布苏病毒病感染的宿主分子流行病学特点，建议将该病病原命名为禽坦布苏病毒(Avian Tembus virus，ATmV)[6]。

ATmV属于黄病毒科黄病毒属，其基因组长度为10 990 bp，含有一个长度为10 278 bp的开放阅读框(Open reading frame，ORF)，编码含3 425个氨基酸的多聚蛋白(Polyprotein)，其各组成蛋白依次为5′-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS- 4B-NS5-3′[7]。目前，在ATmV快速检测方面，已见有RT-PCR[8]、实时荧光定量PCR[9-10]、LAMP[10]、乳胶凝集[11]、免疫层析[12]和ELISA[13]等方法报道，其中的实时荧光定量PCR方法针对ATmV的囊膜蛋白E[9]和非结构蛋白NS5[10]。以往的研究发现，黄病毒科黄病毒属非结构蛋白NS1与病毒毒力密切相关，是一个较为保守的糖蛋白，被广泛用于该属病毒的快速诊断研究[14]。本研究根据ATmV非结构蛋白NS1的基因特征，建立了操作简便、敏感性高、特异性强、重复性好、可实时定量分析ATmV感染程度的TaqMan实时荧光定量PCR方法，以期为ATmV的分子流行病学调查和早期感染研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1试验毒株和鸭胚Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)、新型鸭呼肠孤病毒(N-DRV)、禽流感病毒(AIV)、禽Ⅰ型副粘病毒(AMPV-Ⅰ)、番鸭细小病毒(MDPV)及ATmV鸡源FQ-C1株、鸭源WR株和鹅源GD06株，均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离鉴定并保存。

9～11日龄健康麻鸭胚购自福建莆田某麻鸭养殖场，该麻鸭养殖场未免疫接种过ATmV相关疫苗，且未感染ATmV。对该麻鸭养殖场种鸭血清用本研究团队前期建立的ATmV血清学方法[15]进行监测，结果为阴性。

1.1.2试剂Premix ExTaqTM(Probe qPCR)(Code No. RR390Q)、One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit (Perfect Real Time)(Code No.RR064A)、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2 (Dye Plus)(Code No.RR057A)、EASY Dilution(Code No.9160Q)，均购自宝生物工程(大连)有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒(DP209)、快速质粒小提试剂盒(DP105)、病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(DP315)、pGM-T Fast连接试剂盒(VT207)，均购自天根生化科技(北京)有限公司；其他常规化学试剂和耗材，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2ATmV TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

1.2.1引物的设计与合成参考美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)公布的ATmV非结构蛋白NS1的编码基因特征，利用引物设计软件Oligo(版本v 7.37)设计引物，引物序列为：NS1-TaqManF:5′-GGAGAGTGAACTCATCATA-3′，NS1-TaqManR:5′-GTCGAAGTCTATTACAATCTC-3′；并设计5′端标记FAM、3′端标记Eclipse的探针引物NS1-probe：5′-(FAM) ACCGAAGAGTCATCACAACACGA (Eclipse)-3′。将设计好的引物和探针在NCBI上进行BLAST，分析其特异性。引物和探针均由宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.2.2阳性标准品的构建根据ATmVNS1全长基因特征，利用引物设计软件Oligo(版本v 7.37)设计特异性引物，引物序列为：NSF：5′-CCGGAATTCGAGGCTTGGA-3′和NSR：5′-CCGCTCGAGGACCTTTGATTTGAT-3′，用于扩增约1 000 bp的NS1全长基因片段，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(DP315)提取ATmV核酸RNA，按照PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2 (Dye Plus)(Code No. RR057A)说明书进行RT-PCR反应，反应体系参考试剂盒说明书配制，反应条件为：50 ℃ 反转录30 min后进行PCR反应，PCR程序为：94 ℃ 预变性4 min；94 ℃ 50 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 70 s，35个循环；72 ℃延伸 10 min。用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒(DP209)对特异性目的片段进行切胶回收。按照pGM-T Fast连接试剂盒(VT207)说明书将NS1基因片段克隆到pGM-T载体上，随机挑取8个单菌落于含氨苄青霉素(含量为100 μg/mL)抗性的LB液体培养基培养14 h后，利用快速质粒小提试剂盒(DP105)提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物(NSF/NSR)和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为实时荧光定量PCR的阳性标准品。利用微量核酸测定仪测定阳性重组质粒的浓度，计算其拷贝数为2.67×107拷贝/μL，用EASY Dilution对其进行10倍连续稀释，共稀释5次(质粒含量分别为2.67×106，2.67×105，2.67×104，2.67×103和2.67×102拷贝/μL)，分装后置于-20 ℃保存备用。

1.2.3反应条件的优化及标准曲线的建立按照Premix ExTaqTM(Probe qPCR)试剂盒说明书配制25 μL的实时荧光定量PCR反应体系，在不同退火温度(52，54，56，58，60，62和64 ℃)、引物浓度(2.5，5.0，10和20 μmol/L)及探针浓度(2.5，5.0，10和20 μmol/L)下进行实时荧光定量PCR，对反应条件进行优化。分别以质粒含量为2.67×107，2.67×106，2.67×105，2.67×104，2.67×103和 2.67×102拷贝/μL的标准品作为模板，用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准品起始拷贝数的常用对数(lgC)为横坐标，以循环数阈值(Cycle threshold，Ct值)为纵坐标，推导出标准线性回归方程(标准曲线)。

1.2.4特异性检测用优化后的实时荧光定量PCR条件分别对水禽其他常见病原DHV-Ⅰ、N-DRV、AIV、AMPV-Ⅰ、MDPV及鸡源、鸭源和鹅源ATmV进行实时荧光定量PCR检测。用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取相应病毒的核酸RNA，按照One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit (Perfect Real Time)试剂盒说明书用优化后的反应条件进行检测，评价建立的实时荧光定量PCR方法的特异性。

1.2.5重复性试验用建立的实时荧光定量PCR方法分别对质粒含量为2.67×107，2.67×106，2.67×105，2.67×104，2.67×103和2.67×102拷贝/μL的标准品进行检测，每种质粒含量重复4次，计算组内(Intra-group)变异系数。分别将上述不同质粒含量的标准品分装后置于-20 ℃保存，每隔7 d，用建立的实时荧光定量PCR方法进行检测，共检测4次，计算组间(Inter-group)变异系数。

1.3临床样品的检测

对15份临床送检疑似ATmV感染的病料，用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取相应的核酸RNA，按照One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit (Perfect Real Time)试剂盒说明书用优化后的反应条件，进行实时荧光定量PCR检测。对实时荧光定量PCR方法检测为ATmV阳性的病料，利用9～11日龄健康麻鸭胚进行病毒分离鉴定。同时，对15份临床送检疑似ATmV感染的病料用本研究团队前期建立的常规RT-PCR方法[8]进行检测，计算两种检测方法之间的符合率。

2　结果与分析

2.1ATmV实时荧光定量PCR检测条件的优化

优化出的实时荧光定量PCR方法最佳反应体系(25 μL)如下：Premix ExTaq(Probe qPCR) 12.5 μL、NS1-TaqManF 和NS1-TaqManR 引物(均为10 μmol/L)各0.6 μL、探针NS1-probe(10 μmol/L)0.4 μL、模板2 μL，补充灭菌去离子水至终体积25 μL。优化出的实时荧光定量PCR方法最佳反应条件为： 95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，40个循环。

2.2ATmV实时荧光定量PCR的标准曲线

质粒含量为(2.67×107)～(2.67×102) 拷贝/μL的标准品按优化后的条件进行扩增，获得扩增动力学曲线(图1)。从图1可以看出，本研究建立的实时荧光定量PCR方法最低检测限为2.67×102拷贝/μL。以各标准品中质粒含量(C)的常用对数(lgC)为横坐标(x)，以循环数阈值(Cycle threshold，Ct值)为纵坐标(y)，获得ATmV实时荧光定量PCR标准曲线(图2)，其线性方程为y=-3.167x+38.93，方程斜率为-3.167，相关系数为0.998，扩增效率为99.9%，表明建立的实时荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系。

图 1　ATmV实时荧光定量PCR扩增动力曲线 1～6分别代表质粒含量为2.67×107、2.67×106、2.67×105、2.67×104、2.67×103和2.67×102 拷贝/μL标准品的扩增动力学曲线Fig.1　Dynamic curve for the real time PCR of avian Tembusu virus The plasmid concentrations of dynamic curves 1 to 6 were 2.67×107,2.67×106,2.67×105, 2.67×104,2.67×103 and 2.67×102 copies/μL,respectively

图 2　ATmV实时荧光定量PCR标准曲线Fig.2　Standard curve for the real time PCR of avian Tembusu virus

2.3ATmV实时荧光定量PCR的特异性分析

从图3可以看出，建立的实时荧光定量PCR方法仅对ATmV鸡源FQ-C1株、鸭源WR株和鹅源GD06株有阳性扩增信号，对其他水禽常见病原DHV-Ⅰ、N-DRV、AIV、AMPV-Ⅰ和MDPV等均未检测到荧光信号，表明建立的实时荧光定量PCR方法具有极强的特异性。

2.4ATmV实时荧光定量PCR的重复性

建立的实时荧光定量PCR检测质粒含量为(2.67×107)～(2.67×102) 拷贝/μL的标准品的组内变异系数为0.39%～1.17%，组间变异系数 0.51%～1.82%(表1)。

2.5ATmV实时荧光定量PCR方法对临床样品的检测

对15份临床送检疑似ATmV感染的病料分别进行实时荧光定量PCR和RT-PCR检测，结果发现，实时荧光定量PCR方法检测有11份阳性样品，阳性率为73.33%(11/15)；常规RT-PCR方法检测有9份阳性样品，阳性率为60.00%(9/15)；且RT-PCR检测为阳性的9份样品经实时荧光定量PCR检测均为阳性，符合率为100%。可见，实时荧光定量PCR方法较常规RT-PCR敏感性更高。利用麻鸭胚对实时荧光定量PCR检测为阳性的11份样品进行病毒分离，共分离到5株ATmV，对其进行实时荧光定量PCR和RT-PCR检测，结果均为阳性。

3　讨　论

黄病毒科黄病毒属成员有53个代表种，其中27种可经蚊虫传播，12种可经蜱传播。对ATmV基因组分析发现，其和经蚊虫传播的Sitiawan病毒亲缘关系较近[16]。当前，登革热病毒(Dengue virus，DENV)被作为可经蚊虫传播的黄病毒科黄病毒属代表被广泛研究。对DENV非结构蛋白NS1的研究发现，该蛋白由3个结构域组成，含有多种重要的B淋巴细胞和T淋巴细胞表位，可诱导机体自身保护性免疫，在病毒的致病机制和保护性免疫中具有重要作用，被广泛应用于DENV的早期快速鉴别诊断和亚单位疫苗靶标研究[17-18]。但研究发现，ATmV和DENV的流行病学方面存在较大差异，ATmV在冬天蚊虫较少时仍传播迅速，可通过直接接触和气溶胶传播[19]。研究还发现，基于ATmV非结构蛋白NS1建立的NS1-ELISA不能对ATmV灭活疫苗免疫血清和自然感染血清进行鉴别诊断[20]，这和DENV的NS1蛋白可有效用于其鉴别诊断也不一致[21]。

图 3　ATmV实时荧光定量PCR的特异性检测 1.ATmV鸭源WR株；2.ATmV鸡源FQ-C1株；3.ATmV鹅源GD06株； 4.其他水禽常见病原DHV-Ⅰ、N-DRV、AIV、AMPV-Ⅰ和MDPVFig.3　Specificity test for the real time PCR of avian Tembusu virus 1.Duck-origin ATmV strain WR;2.Chicken-origin ATmV strain FQ-C1;3.Goose-origin ATmV strain GD06;4.Common waterfowl viruses, such as duck hepatitis virus type 1,novel duck reovirus,avian influenza virus,avian paramyxovirus-Ⅰand Muscovy duck parvovirus表 1　ATmV实时荧光定量PCR的组内和组间变异系数Table 1　Reproducibility test of intra-and inter-assay for the real-time PCR

质粒含量/(拷贝·μL-1)Plasmidsconcentration组内变异系数/%CVofintra-group组间变异系数/%CVofinter-group2.67×1070.530.652.67×1060.680.892.67×1050.390.512.67×1040.470.712.67×1030.720.972.67×1021.171.82

实时荧光定量PCR技术标准品的选择对试验结果至关重要，标准品需要与待检测的样本类型相同(或相似)[22-23]。在标准品的选择上，有选用连续稀释的病毒核酸RNA作标准品，用其建立实时荧光定量PCR的标准曲线，但提取的核酸RNA极易被RNase降解，易导致试验结果的误读误判，对试验条件要求较高。还有研究发现，ATmV暴发的养鸭场工人可检测到ATmV感染[24]，可见ATmV完整的病毒颗粒(或其基因组mRNA)具有感染性，因此不宜作为标准品[25]。另外，见有将RNA反转录成cDNA作为标准品，该方法对RNA的提取质量要求较高，不易大量制备，并在后续开发实时荧光定量PCR试剂盒时需多次反转录，导致试验步骤复杂，且试验过程中需多次开盖，RNA污染和降解的几率增大，无法满足后续开发诊断试剂盒对标准品的一致性要求。本研究选用包含ATmVNS1基因扩增片段的质粒作为标准品，该标准品纯度高，质量好，构建好的质粒可长期保存，满足了后续试验的连续性和开发诊断试剂盒标准品的一致性要求。

本研究针对ATmV的NS1基因设计特异性的引物和探针，建立检测ATmV的TaqMan实时荧光定量PCR方法，该方法对ATmV鸡源FQ-C1株、鸭源WR株和鹅源GD06株检测结果为阳性，对其他常见水禽病原检测结果均为阴性，组内试验和组间试验的变异系数低(最高仅为1.82%)，表明建立的实时荧光定量PCR方法特异性强、重复性好。用本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法对临床疑似ATmV感染的病料进行检测，发现其检测结果和常规RT-PCR符合率为100%，表明针对NS1基因建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法可有效用于开发ATmV的快速诊断试剂盒研究。

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Development of a TaqMan-based real-time PCR method for avian Tembusu virus

WAN Chunhe,CHEN Cuiteng,FU Qiuling,CHENG Longfei,FU Guanghua,CHEN Hongmei,SHI Shaohua,HUANG Yu

(InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicineofFujianAcademyofAgriculturalScience,FujianAnimalDiseaseControlTechnologyDevelopmentCenter,Fuzhou,Fujian350013,China)

【Objective】 This study developed a TaqMan-based real-time PCR method for avian Tembusu virus (ATmV).【Method】 A TaqMan-based real-time PCR method was developed for detection of ATmV with specific primers and probe targeting to the nonstructural 1(NS1) gene.The specificity and repeatability of the method were also detected.Fifteen suspected ATmV infection samples were tested by the established method and the coincidence rate was calculated by comparing with conventional RT-PCR method.【Result】 The successfully established real-time PCR method had good linear correlation whenNS1 gene content was (2.67×102)-(2.67×107) DNA copies/μL with correlation coefficient (R2) of 0.998 and efficiency of 99.9%.The lower detection limit was 2.67×102copies/μL.No amplification was detected from common waterfowl origin viruses,such as duck hepatitis virus type 1,novel duck reovirus,avian influenza virus,and avian paramyxovirus-Ⅰand Muscovy duck parvovirus.Reproducibility test showed that the intra- and inter-assay were 0.39%-1.17% and 0.51%-1.82%,respectively.Fifteen clinical samples were tested by the established TaqMan-based real-time PCR method and the RT-PCR method and their positive rates were 73.33% (11/15) and 60.0% (9/15),respectively.RT-PCR positive samples were tested positive by the real time PCR method,with the coincidence rate was 100.0%.【Conclusion】 The established TaqMan-based real-time PCR method provided a useful method for early diagnosis of avian tembusu virus.

avian Tembusu virus;NS1 gene;TaqMan;real time PCR method

网络出版时间:2016-07-1208:4510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.08.008

2014-12-16

国家现代水禽产业体系项目(CARS-43)；福建省属公益类项目(2015R1023-7)；福建省农业科学院“青年科技英才百人计划”项目(YC2015-12)；福建省农业科学院青年人才创新基金项目(2014QA-7)

万春和(1982-)，男，湖北鄂州人，助理研究员，在读博士，主要从事水禽病原分子生物学研究。

E-mail:chunhewan@126.com

黄瑜(1965-)，男，江西宁都人，研究员，硕士生导师，主要从事畜禽传染病研究。E-mail:huangyu_815@163.com

S858.32

A

1671-9387(2016)08-0049-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160712.0845.016.html