自然低温对茶树内源激素含量的影响

曾光辉，马青平，王伟东，周琳，尹盈，黎星辉*



自然低温对茶树内源激素含量的影响

曾光辉1,2，马青平2，王伟东2，周琳2，尹盈2，黎星辉2*

1.温州科技职业学院，浙江 温州 325006；2. 南京农业大学园艺学院，江苏 南京210095

以南京中山陵茶园中十年生龙井长叶茶树为试验材料，用酶联免疫法（ELISA）测定自然低温下茶树叶片内源激素含量的变化，以探讨自然低温下茶树内源激素变化规律。结果显示，自然越冬期间，茶树叶片中吲哚乙酸（IAA）含量的波动幅度最大，脱落酸（ABA）次之，而赤霉素（GA3）与玉米素核苷（ZR）波动幅度较小；同时，除了ABA外，茶树其他内源激素IAA、ZR和GA3含量变化趋势一致；激素间比值变化和相关性分析显示ZR与GA3、ZR与IAA、IAA与GA3含量变化极显著相关，ABA与IAA、ABA与ZR呈显著正相关。试验结果表明，茶树内源激素之间关系密切，茶树可能通过调控ABA/(GA3+IAA+ZR)的比值来适应自然低温环境。

茶树；自然低温；内源激素

低温是影响茶树（(L.) Kuntze）生长和繁殖的重要因素，冬季的极端低温和初春的“霜冻”或“倒春寒”常常造成茶树的低温伤害，制约茶叶产业发展[1-2]。

植物内源激素是植物生长发育过程中重要的调节物质，主要包括生长素类（IAA）、脱落酸（ABA）、细胞分裂素（CTK）、赤霉素类（GAs）和乙烯类（Eth），以及油菜素甾体类（BRs）、多胺类（PA）及茉莉酸类（JA）等近似激素类物质[3]。植物内源激素几乎参与了植物生长发育过程中所有生理过程的调节，同时在非生物胁迫中也起着至关重要的作用[3-6]。其中，关于植物内源激素在低温胁迫下的响应，国内外已有大量的研究报道。曲凌慧等[7]研究表明，低温下葡萄叶片中出现ABA和JA的猝发。Xu等[8]研究显示，冷胁迫诱导ABA的合成，且外源ABA能够提高植株的抗寒性，意味着ABA在植物适应低温环境中具有重要作用。其他激素，特别是CTK、水杨酸（SA）和JA，也被证实在植物对低温胁迫的响应过程中发挥直接或间接的作用[3]。茶树内源激素的研究起步相对较晚，且偏重于激素对茶树生长发育影响的研究。其中，Pan等[9]研究发现，茶树新梢的生长受IAA和ABA含量的影响，更受二者比值的影响；潘根生等[10-12]发现，低ABA/GA3和ABA/玉米素（ZT）比值是茶树新梢生长的必要条件，而高ABA/GA3和ABA/ZT比值则是诱发茶树新梢冬季休眠的主要原因，且新梢的生长速率与内源ZT含量呈显著正相关，表明ABA、GA3和ZT间的相互作用对茶树新梢生长起着重要作用。目前，关于植物内源激素与茶树抗性的研究较少，且集中在茶树耐旱与其内源激素关系的研究。潘根生等[13]研究表明，耐旱型茶树具有较高的ABA/ZT比值和水分利用率，这可作为茶树耐旱性的育种指标。然而，由于茶树中内源激素测定技术的限制，低温对茶树叶片中内源激素含量影响的研究尚未见报道，而内源激素可能是茶树耐寒的一个重要机制，本试验测定分析了龙井长叶在自然低温期间叶片中内源激素的含量，以探讨自然低温下茶树内源激素的变化规律，从而为进一步深入研究茶树耐寒与其内源激素的关系研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料与试验设计

茶树供试材料为栽植于南京中山陵茶园的十年生龙井长叶品种茶树。

随机选取60株生长良好且长势一致的茶树植株作为样株，并挂牌标记。于2012年11月15日开始，到翌年4月1日，每隔15 d对相同部位的完整、无病虫害成熟叶片进行取样，取样时间为上午8：00。所取样品用蒸馏水清洗干净并用滤纸吸干多余水分，称重后放入液氮速冻，－70℃冰箱保存。试验期间，取样当天的气温由南京市气象局中山植物园观测站提供（表1）。

1.2 内源激素的提取与测定

植物内源激素的提取参考吴曼等[14]所述，将植物样品置于预冷的研钵中，加入2 mL提取液（80%冷甲醇，含1 mmol∙L-1二叔丁基对甲苯酚）并研磨至匀浆，转入10 mL试管，再用2 mL提取液分次将研钵冲洗干净，一并转入试管中。充分混匀，于4℃下提取4 h，3 500 r·min-1离心8 min，取上清液；沉淀中加1 mL提取液，搅匀，置于4℃下再提取1 h，离心后合并上清液并记录体积。上清液通过C18固相萃取柱进行纯化，收集液经真空干燥后稀释定容用于后续实验。参照李宗霆等[15]所述，通过酶联免疫吸附分析法（Enzyme- linked Immunosorbent Assays，ELISA）测定样品中吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3）、玉米素核苷（ZR）和脱落酸（ABA）含量。

1.3 数据统计分析

试验数据为多次重复的平均值，使用Excel 2007与SPSS 20.0统计软件分析各组试验结果数据的平均值与标准偏差，采用新复极差法（Duncan’s）进行多重比较，使用Excel 2007作图描绘各组处理及试验指标的变化曲线。

2 结果与分析

2.1 自然越冬期间茶树叶片内源激素含量的变化

2.1.1 茶树叶片IAA含量的变化

如图1所示，自然越冬期间茶树叶片内IAA含量的变化幅度较大，2012年11月15日IAA含量为26.33 ng·g-1，11月30日IAA含量达到81.83 ng·g-1，12月15日降至36.01 ng·g-1。另外，12月31日至1月30日间，最低气温在0℃以下，IAA含量均较高；
1月30日至3月1日间，随着气温的上升，IAA含量显著降低；3月15日至3月30日间，IAA含量均高于80 ng·g-1。

2.1.2 茶树叶片ZR含量的变化

ZR在促进细胞分裂，保证核酸和蛋白质免遭破坏，以及促进核酸和蛋白质的积累方面起着重要作用。自然越冬期间茶树叶片ZR含量的变化趋势与IAA基本一致（图2），ZR含量在越冬期间虽有显著变化，但其含量较低，均在6.0~14.0 ng·g-1之间。

2.1.3 茶树叶片ABA含量的变化

自然越冬期间，茶树叶片脱落酸（ABA）含量为80~165 ng·g-1，保持着较高浓度（图3）。11月15日至1月15日期间以及3月1日至3月30日期间，ABA含量变化趋势基本与IAA一致；而1月30日至2月15日期间，ABA含量逐渐增高，IAA则显著降低。

2.1.4 茶树叶片GA3含量的变化

茶树叶片在自然越冬期间赤霉素（GA3）含量变化如图4所示，越冬期间，除了1月30日与3月15日时GA3含量分别高达16.22、13.47 ng·g-1，其余时间含量在4.93~9.05 ng·g-1间波动。

总之，自然越冬期间，茶树叶片中内源激素波动幅度依次为IAA>ABA>GA3>ZR，其中IAA、ZR和GA3含量变化趋势一致，ABA含量变化略有不同。

2.2 自然越冬期间茶树叶片内源激素比例的变化

为了研究自然越冬期间茶树叶片中各激素间的相互作用，对内源激素间的比值变化进行了分析。如表2所示，自然越冬期间，ABA含量基本均高于IAA、ZR、GA3含量。ABA含量在2013年1月30日时略低于IAA含量，同时该天ABA含量较低，ABA/IAA、ABA/ZR、ABA/GA3和ABA/（GA3+IAA+ZR）为越冬期间比值最低值。ABA/（GA3+IAA+ZR）在自然越冬期间，在最低气温低于0℃期间（2012年12月31日至2013年1月30日以及2013年3月15日至3月31日）比值较小。

2.3 自然越冬期茶树叶片内源激素相关性比较

如表3所示，在自然低温期间，茶树叶片中ZR与GA3含量、ZR与IAA含量、IAA与GA3含量极显著相关，相关系数分别为0.831、0.812、0.729；ABA与IAA、ABA与ZR呈显著正相关，关系数分别为0.270、0.283；ABA与GA3相关性不显著。

3 讨论

植物激素在生物信号间存在相互作用，包括生物合成、代谢与运输、信号转导途径等方面的相互作用[6,16-18]。姚永宏等[19]研究表明，秋季茶树内源激素波动幅度IAA最大，ABA次之，而ZR最小；IAA、ZR含量变化趋势相近，但与ABA相反。本试验中，自然越冬期间，内源激素波动幅度IAA＞ABA＞GA3＞ZR，同时，IAA和ZR含量变化趋势一致，这与姚永宏的研究结果基本一致。与秋季不同的是，茶树内源激素ABA在冬季期间仅在1月30日至2月15日期间变化趋势相反，与IAA变化趋势不一致。

生长素是最早发现的一类植物激素，它调控侧根形成、维管组织分化、顶端优势以及植物的向性反应等。本试验中，当最低气温低于0℃时，IAA含量均保持较高值。近年来，ABA已经被认为是一种胁迫激素，在植物抗寒力的调控以及对维持细胞膜结构功能方面起着重要作用；植物受到生物和非生物胁迫后，内源ABA含量增加，并诱导多种抗逆基因的表达，从而增强其抗逆性；ABA含量的增加对于植物抗性的提高有明显作用已被证实[20-23]。在自然越冬期间，ABA浓度始终高于85 ng·g-1。因此，自然越冬期间，IAA和ABA含量较高，同时波动幅度较大，两种激素可能在越冬期间起着重要的调控作用，其含量高低可能是影响茶树抗寒性的重要指示因子。

玉米素核苷（ZR）是细胞分裂素之一，产生于植物根部，由叶片的蒸腾作用随木质部向上运输[24]。自然越冬期间，ZR的变化规律可能与越冬期间气温较低有关，越冬期间最高气温、最低气温、平均气温分别低于20℃、7℃、12℃；低温下，根系活力较低，蒸腾作用少，因此叶片中ZR含量较低，变化幅度小。赤霉素类（GAs）是种类最多的植物激素，能刺激细胞分裂和伸长，对植物顶端幼嫩部分形成，促进植物的伸长生长等具有显著效应。试验期间，茶树生长缓慢，选择成熟叶片作为材料，因此测得的GA3含量均在20 ng·g-1以下，且变化幅度较小。

IAA、GA3、ZR为促生长类激素，能影响细胞的伸长、分裂和分化，对植物的生长发育有促进作用，在逆境胁迫下该类激素含量降低，可使植物生长速度减慢[25-26]。本试验中，ABA/ZR和ABA/GA3比值虽然在2013年3月1日至3月15日期间随着气温的升高有所降低，但在整个自然越冬期间一直保持着较高值。由此可见在自然低温期间，随着温度的降低，茶树可能通过对内源激素的调控，增加ABA的合成，减少IAA、ZR和GA3的合成，使茶树进入冬季休眠或保持休眠状态，以减轻低温对茶树的伤害。3月1日至3月15日期间随着气温的显著升高，IAA、ZR、GA3合成速率也提高，导致了ABA/IAA、ABA/ZR和ABA/GA3比值下降，促进了茶树新梢的生长。而3月15日至3月30日期间，IAA与ABA含量显著降低，这种变化可能由温度升高后，新梢生长过程中展叶数增加导致的。

植物激素在生长发育和适应环境变化的过程中，并不是孤立地起作用，而是受多种激素相互作用共同调节。试验结果表明，自然低温期间ZR与GA3、ZR与IAA、IAA与GA3含量变化极显著相关；ABA与IAA、ABA与ZR显著正相关；ABA与GA3相关性不显著。由此可见，茶树内源激素虽然含量很低，但它们在调节茶树的生长、生理和新陈代谢等各个方面起着重要的调控作用。茶树对低温的适应是一个复杂的综合反映，内源激素的调节起着非常重要的作用，对茶树营养器官和生殖器官在不同低温条件下内源激素的变化、相互关系及其对应基因表达的深入研究，将有助于了解茶树对低温的响应机制，从而在丰富茶树生物学理论和促进茶叶生产方面发挥积极作用。

[1] 邹中伟, 房婉萍, 张定, 等. 低温胁迫下茶树基因表达的差异分析[J]. 茶叶科学, 2008, 28(4): 249-254.

[2] 朱全武, 范凯, 谢艳兰, 等. 植物低温胁迫响应miRNAs及其在茶树抗寒研究中的应用[J]. 茶叶科学, 2013, 33(3): 212-220.

[3] Peleg Z, Blumwald E. Hormone balance and abiotic stress tolerance in crop plants [J]. Current Opinion in Plant Biology, 2011, 14(3): 290-295.

[4] Baron K N, Schroeder D F, Stasolla C. Transcriptional response of abscisic acid (ABA) metabolism and transport to coldand heat stress applied at the reproductive stage of development in Arabidopsisthaliana [J]. Plant Science, 2012, 188: 48-59.

[5] Durbak A, Yao H, McSteen P. Hormone signaling in plant development [J]. Current opinion in plant biology, 2012, 15(1): 92-96.

[6] Du H, Wu N, Chang Y, et al. Carotenoid deficiency impairs ABA and IAA biosynthesisand differentially affects drought and cold tolerance in rice [J]. Plant molecular biology, 2013, 83(4): 475-488.

[7] 曲凌慧, 车永梅, 刘新, 等. ABA和JA等激素参与葡萄对低温胁迫的应答[J]. 青岛农业大学学报: 自然科学版, 2010, 27(1): 36-41.

[8] Xu X X, Shao H B, Mi Y Y, et al. Biotechnological implications from abscisic acid (ABA) roles in cold stress and leaf senescence as an important signal for improving plant sustainable survival under abiotic-stressed conditions [J]. Critical Reviews in Biotechnology, 2010, 30(3): 222-230.

[9] Pan G S, Masaki T, Shigeki K. A study on the relationships between the growth of tea and endogenous hormones IAA and ABA [J]. Acta Agriculturae Universitatis Zhejiangensis, 1992, 18(S): 133-137.

[10] 潘根生, 沈生荣, 钱利生, 等. 茶树新梢生育的内源激素水平及其调控机理: 第一报[J]. 茶叶, 2000, 26(3): 139-143.

[11] 潘根生, 沈生荣, 钱利生, 等. 茶树新梢生育的内源激素水平及其调控机理: 第二报[J]. 茶叶, 2000, 26(4): 200-204.

[12] 潘根生, 沈生荣, 吴伯千, 等. 茶树新梢生育过程内源激素水平的变化[J]. 茶叶科学, 1997, 17(增刊1): 86-91.

[13] 潘根生, 吴伯千, 沈生荣, 等. 水分胁迫过程中茶树新梢内源激素水平的消长及其与耐旱性的关系[J]. 中国农业科学, 1996, 29(35): 9-15.

[14] 吴曼, 张文会, 王荣, 等. ‘红丽’海棠早实植株发育过程中内源激素变化[J]. 园艺学报, 2013, 40(1): 10-20.

[15] 李宗霆, 周燮. 植物激素及其免疫检测技术[M]. 南京: 江苏科学技术出版社, 1996: 279-286.

[16] Golenberg E W, West N W. Hormonal interactions and gene regulation can link monoecy and environmental plasticity to the evolution of dioecy in plants [J]. American Journal of Botany, 2013, 100(6): 1022-1037.

[17] Miransari M, Smith D L. Plant hormones and seed germination [J]. Environmental and Experimental Botany, 2014, 99: 110-121.

[18] Cheng Y Q, Liu J F, Yang X D, et al. Construction of ethylene regulatory network based on the phytohormones related gene transcriptome profiling and prediction of transcription factor activities in soybean [J]. Acta Physiologiae Plantarum, 2013, 35(4): 1303-1317.

[19] 姚永宏, 徐泽, 侯渝嘉, 等. 秋季茶树内源激素的ELISA分析及其在不同器官中的分布[J]. 渝西学院学报: 自然科学版, 2005, 4(4): 26-33.

[20] Cao F Y, Yoshioka K, Desveaux D. The roles of ABA in plant–pathogen interactions [J]. Journal of Plant Research, 2011, 124(4): 489-499.

[21] Lee S C, Luan S. ABA signal transduction at the crossroad of biotic and abiotic stress responses [J]. Plant Cell and Environment, 2012, 35(1): 53-60.

[22] Nakamura T, Yazaki J, KishimotoN, et al. Comparison of long-term up-regulated genes during induction of freezing tolerance by cold and ABA in bromegrass cell cultures revealed by microarray analyses [J]. Plant Growth Regulation, 2013, 71(2): 113-136.

[23] Danquah A, Zelicourt A D, Colcombet J, et al. The role of ABA and MAPK signaling pathways in plant abiotic stress responses [J]. Plant Biotechnology, 2014, 32(1): 40-52.

[24] Hansen H, Dörffling K. Root-derived trans-zeatinriboside and abscisic acid in drought-stressed and rewatered sunflower plants: interaction in the control of leaf diffusive resistance? [J]. Functional Plant Biology，2003, 30(4): 365 -375.

[25] 张根发, 王舒静, 张桂芳, 等. 低温和植物生长调节物质处理对好好芭无性系试管苗抗寒相关酶类活性的影响[J]. 中国油料作物学报, 2003, 25(3): 59-63.

[26] Wang C R, Yang A F, Yin H Y, et al. Influence of water stress on endogenous hormone contents and cell damage of maize seedlings [J]. Journal of Integrative Plant Biology, 2008, 50(4): 427-434.

Effect of Natural Low-temperature on Endogenous Hormones of(L.) Kuntze Plant

ZENG Guanghui1,2, MA Qingping2, WANG Weidong2, ZHOU Lin2, YIN Ying2, LI Xinghui2*

1. Wenzhou Vocational College of Science and Technology, Wenzhou 325006, China; 2. College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

To understand the changes of endogenous hormones in tea plant [(L.) O. Kuntze] under natural low-temperature, ten-year-old tea plants of the cultivar ‘Longjingchangye’ were used as the material and the changes of endogenous hormones content were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The results showed that the fluctuation amplitude of indole acetic acid (IAA) content is highest among all detected hormones during overwintering period. The change of abscisic acid (ABA) content was smaller than IAA but higher than that of gibberellins (GA3) and zeatinriboside (ZR). In addition, the changing trends of IAA, ZR and GA3content is consistent, while the trend of ABA is different from them. Furthermore, the changes between ZR and GA3, ZR and IAA, IAA and GA3content were significantly related. As well, there are significant positive correlations between ABA and IAA, ZR, respectively. All of the above results suggest that endogenous hormones in tea plant are closely related under natural low-temperature. Tea plant may regulate the ratio of ABA/(GA3+ IAA + ZR) to adapt to low temperature.

tea plant, natural low temperature, endogenous hormone

S571.1；Q946.885

A

1000-369X（2016）01-085-07

2015-08-17

2015-10-20

现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-23）、国家自然科学基金（31470690）、南京市科技计划（201301076）、浙江省教育厅高等学校访问学者专业发展项目（FX2012146）。

曾光辉，男，副教授，主要从事园艺作物生理生态研究。*通讯作者：lxh@njau.edu.cn