杀青方式对夏季绿茶化学成分及滋味品质的影响

祁丹丹，戴伟东，谭俊峰，彭群华，张悦，林智*



杀青方式对夏季绿茶化学成分及滋味品质的影响

祁丹丹1,2，戴伟东1，谭俊峰1，彭群华1，张悦1，林智1*

1. 农业部茶树生物学与资源利用重点实验室 中国农业科学院茶叶研究所，浙江 杭州 310008；2. 中国农业科学院研究生院，北京 100081

杀青是绿茶加工的关键工序，对绿茶品质的形成具有重要作用。为探究杀青方式对夏季绿茶化学成分及滋味品质的影响，采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）对微波杀青、滚筒杀青、蒸汽杀青3种杀青方式加工后的夏季绿茶进行化学成分分析，同时，分别采用咖啡碱、表没食子儿茶素没食子酸酯和谷氨酸钠为标准苦味、涩味和鲜味物质对3种杀青方式加工的夏季绿茶进行滋味强度分析。液质联用分析结果表明，蒸汽杀青、滚筒杀青、微波杀青对夏季绿茶中的儿茶素、黄酮糖苷、原花青素、聚酯型儿茶素、氨基酸、酚酸和有机酸等化学成分含量具有明显的影响。滋味等效量化结果表明，杀青方式可以较明显地改变夏季绿茶的滋味，不同杀青方式加工绿茶的苦味强度为：滚筒杀青＞蒸汽杀青＞微波杀青；涩味强度为：蒸汽杀青＞滚筒杀青＞微波杀青；鲜味强度3种杀青方式间无统计学显著差异。

夏季绿茶；杀青方式；滋味；化学成分；液质联用

我国是产茶大国，以生产绿茶为主。绿茶制作中酶的热变性在工艺上称为“杀青”[1]，是绿茶制作的关键工序，对绿茶的感官品质和化学成分组成具有重要的影响，已有部分研究对此进行了探索。如赵沙鸥[2]比较了3种不同杀青方式对夏秋茶品质的影响：微波杀青绿茶在干茶外形、汤色、滋味方面均优于传统滚筒杀青绿茶，且有利于保持绿茶茶多酚、维生素、叶绿素等内含成分的含量；滚筒杀青绿茶条索较差，茶汤浅绿，叶底绿黄欠亮，花杂有红边、红梗。周天山等[3]从感官品质和理化性质两方面分析了4种不同杀青方式对绿茶品质的影响，结果表明，微波杀青绿茶的茶多酚、氨基酸、咖啡碱、水浸出物含量均高于滚筒杀青绿茶，干茶色泽也较好；滚筒杀青绿茶酚氨比高于微波杀青绿茶，即滚筒杀青绿茶苦涩味比微波杀青绿茶重，但具有高长的清栗香。胡云铃等[4]比较了滚筒杀青、汽热杀青和热风杀青对绿茶品质的影响，发现汽热杀青绿茶干茶、汤色、叶底均较绿，茶汤滋味浓烈，茶多酚、酯型儿茶素、咖啡碱含量均高于其他两种杀青方式绿茶。钟应富等[5]的研究表明，汽热杀青绿茶深绿油润、均匀。蒸汽杀青绿茶香型为清香型[6]，但蒸汽杀青叶含水量较高不容易揉捻做形[7]。齐桂年等[8]研究发现，微波杀青绿茶对茶叶有效成分的保留有利，滋味比传统工艺的绿茶更鲜爽醇和。

现有的研究多是围绕儿茶素、咖啡碱、氨基酸等成分，然而茶汤中的呈味成分并不局限于这几类物质，酚氨比值也并不是唯一影响茶汤苦涩味的因子。为系统地研究杀青方式对夏季绿茶化学成分及滋味的影响，需对夏季绿茶化学成分及滋味进行全面的量化分析。因此，本研究采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）分析了滚筒杀青、蒸汽杀青、微波杀青3种杀青方式制作的夏季绿茶的化学成分，并采用标准滋味物质对茶叶的滋味进行等效量化评分，旨在阐明杀青方式对夏季绿茶非挥发性物质的影响，并探索这些物质与夏季绿茶鲜、苦、涩味之间的相关关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

6CST-40型滚筒杀青机（浙江上洋机械有限公司），6CHM-901型电热式碧螺春烘干机（杭州富阳茶叶机械总厂制造），Panasonic NN-GD577M型微波炉（上海松下微波炉有限公司），多功能高速粉碎机XQ100克型（670 W，上海广沙工贸有限公司）。

实验用水为Milli-Q超纯水。实验所用的甲醇（99.9%）购自美国Tedia公司，所用的乙腈购自德国默克公司。审评所用的谷氨酸钠（≥99%）购自于东京化成工业株式会社，咖啡碱购于Enzo Life Science公司，表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG，≥95%）购于禾田生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 夏季绿茶样品制作过程

以夏季龙井43一芽二三叶鲜叶为原料，绿茶加工过程具体如下，每种杀青方式的样品平行制作3份（每份鲜叶重500 g左右）：

微波杀青：鲜叶→摊放（2 h左右）→微波杀青（100 s）→毛火干燥（120℃，20 min）→足火干燥（90℃，40 min）

蒸汽杀青：鲜叶→摊放（2 h左右）→蒸汽杀青（110 s）→毛火干燥（120℃，20 min）→足火干燥（90℃，40 min）

滚筒杀青：鲜叶→摊放（2h左右）→滚筒杀青（90s）→毛火干燥（120℃，20 min）→足火干燥（90℃，40 min）

以上3种杀青方式获得的干茶利用多功能高速粉碎机进行粉碎（获得的茶粉大约100目），收集粉末制备茶汤，用于化学成分分析和滋味强度量化评分。

1.2.2 茶汤制备

茶汤提取方法在GB/T 8313—2008的基础上进行改进。配制70%的甲醇水溶液，置于70℃的水浴锅中预热；准确称量0.5 g茶粉，置于离心管中，加入50 mL 70℃的70%甲醇溶液，在70℃的水浴锅中水浴加热30 min，每隔10 min摇晃1次。取出冷却至室温，放入冷冻离心机离心，转速8 000 r·min-1，温度20℃，时间10 min，然后取上清液稀释5倍，过0.22 μm的有机系滤膜后用于超高效液相色谱质谱分析。每个样品平行预处理2份并分别进行基于LC-MS的化学成分分析。

1.3 UPLC-Q-TOF/MS分析条件

色谱柱：Acquity UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm，Waters公司）；流动相：A相为0.1%甲酸，B相为乙腈；进样量：5 μL；流速：0.35 mL·min-1；柱温：45℃。流动相线性梯度洗脱为：0~7.0 min：8%B；7.0~9.5 min：25%B；9.5~10.5 min：98%B；10.5~14.0 min：8%B。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：负离子模式；锥孔气流和雾化气流速分别为50 L·h-1和600 L·h-1；离子喷雾电压：－2.5 kV；离子源温度为120℃；质谱扫描范围：m/z：100~1 500。LockSpray参比离子m/z为554.2615，用于校正在采样过程中离子的精确质量数。

1.4 夏季绿茶滋味品质分析

夏季绿茶鲜味、苦味、涩味等效量化审评方法在徐文平[9]的方法上加以改进，具体为：以咖啡碱为标准苦味物质，EGCG为标准涩味物质，谷氨酸钠为标准鲜味物质，配制成一系列梯度浓度溶液，对5位审评人员进行滋味强度审评训练，标准品浓度及对应的滋味强度分值如表1所示。

夏季绿茶茶汤制备方法：准确称取1 g上述茶粉置于100 mL锥形瓶中，加入100 mL沸水，摇匀后浸提5 min，过滤取上清液至100 mL的容量瓶中备用。

按编号顺序依次取5 mL茶汤置于品茗杯中，让审评员依次鉴定茶汤的鲜、苦、涩强度，并根据鲜、苦、涩的标准溶液所建立的滋味强度与分值的关系对茶汤溶液进行量化打分。

2 结果与分析

2.1 杀青方式对夏季绿茶化学成分的影响

2.1.1 3种杀青方式夏季绿茶的化学成分分析

利用UPLC-Q-TOF/MS在负离子检测模式下对3种不同杀青方式夏季绿茶提取的非挥发性成分进行分析。茶叶中化合物得到较好的色谱分离，经峰识别与峰匹配后，共得到465个化合物特征离子用于多变量统计学分析。首先，采用无监督的主成分分析（PCA）考察微波杀青、滚筒杀青、蒸汽杀青对茶叶化学成分的影响，发现3种杀青方式处理后的茶叶整体代谢组呈现明显的区别（图1-A）。其中，蒸汽杀青夏季绿茶样品分布在第1象限（右上象限）与第4象限（右下象限）内，微波杀青夏季绿茶样品集中分布在第2象限（左上象限）内，滚筒杀青夏季绿茶集中分布在第3象限（左下象限）内，3种不同杀青方式样品得到了很好的区分，表明不同杀青方式对夏季绿茶化学成分具有明显影响。为进一步发现受杀青方式影响最为明显的化合物，采用偏最小二乘判别分析法（PLS-DA）（图1-B）和S-plot图（图1-C）筛选对3组茶叶分类贡献最大的代谢物离子。利用标样结合二级质谱、精确分子量和文献的方式鉴定了其中62个差异化合物，结果如表2所示。交叉验证表明，该PLS-DA模型未过拟合，结果可靠（图1-D）。

2.1.2 杀青方式对儿茶素含量的影响

从表2可以看出，滚筒杀青的夏季绿茶样品中儿茶素（C）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的含量显著低于蒸汽杀青的样品；微波杀青样品中C、GC、EC、EGC、ECG和EGCG 6种儿茶素含量均显著低于滚筒杀青和蒸汽杀青的样品。

2.1.3 杀青方式对黄酮糖苷含量的影响

表2 不同杀青方式夏季绿茶样品的差异化合物及其方差分析P值

续表2

序号No.化合物Compounds保留时间Retention time/min实际测量m/z值Detected mass质谱响应值（均值±标准方差）Mass intensity（Mean±SD）P值(ANOVA)P value 微波杀青滚筒杀青蒸汽杀青 39核糖酸0.71165.04012.2±1.17.0±1.9△△10.9±2.7$0.001 40葡萄糖*0.72179.05633.0±2.126.5±3.4△△32.3±3.4$0.004 41尿苷酸0.72323.02937.3±5.559.2±5.3△△71.7±10.3##,$<0.001 42乙酰鸟氨酸0.75173.09330.3±5.216.8±1.3△△26.4±3.0$$<0.001 43柠檬酸*0.76191.01919.6±2.625.9±3.4△△32.7±5.3##,$<0.001 44胡萝卜酸0.76203.02012.4±1.712.3±1.318.7±2.1##,$$<0.001 45没食子酰葡萄糖0.91331.068359.0±13.6335.7±18.7△522.0±58.7##,$$<0.001 46异柠檬酸0.91191.01926.5±2.439.7±3.2△△47.9±5.2##,$$<0.001 47咖啡酸*1.28179.03514.1±1.923.6±2.0△△23.7±4.0##<0.001 48水杨酸1.77137.0246358.4±385.76805.7±294.3△8165.9±704.6##,$$0.184 49双没食子酰葡萄糖1.82483.07833.9±4.225.3±2.0△△46.3±10.8#,$$<0.001 50香豆酸2.07163.04027.8±2.439.0±3.6△△43.9±4.2##<0.001 51地榆素H42.09633.072455.4±59.2364.3±57.1△493.5±100.0$0.026 523-O-p-香豆酰奎尼酸2.86337.094159.1±10.184.4±8.4△△172.7±20.8$$<0.001 53莽草酸*2.86173.04621.0±2.311.8±1.4△△24.1±3.3$$<0.001 54没食子酸*2.90169.0142650.3±94.42690.0±64.12871.0±183.2#,$0.018 55聚酯型儿茶素F3.33897.152279.5±15.4305.5±35.1420.4±99.3##,$0.003 56三没食子酰葡萄糖3.36635.088256.9±26.0185.9±23.4△△302.5±72.6$$0.002 57表阿夫儿茶精*3.78273.0779.0±1.98.9±2.211.7±3.50.123 58芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡糖苷*4.07563.1403.0±1.51.6±1.14.2±2.80.058 59异牡荆素*4.54431.09923.7±4.727.1±3.529.1±5.40.463 60表阿夫儿茶精没食子酸酯5.70425.088186.3±14.0195.7±23.2238.6±41.6#0.014 615,4'-二羟基-3,3'-二甲氧基-6:7-亚甲基二氧黄酮8.70357.06221.8±3.722.0±1.429.6±1.6##,$$<0.001 62磷脂酰甘油（34:2）10.20745.502100.7±52.7264.1±27.8△△232.9±82.1##<0.001

注：*化合物经过标样验证，其余化合物通过二级质谱结合精确分子量、数据库及相关文献鉴定。-检验：微波杀青与滚筒杀青相比：△：<0.05，△△：<0.01；微波杀青与蒸汽杀青相比：#：<0.05，##：<0.01；滚筒杀青与蒸汽杀青相比：$：<0.05，$$：<0.01。

Note: * Compounds were identified with standards, others were identified by tandem mass spectrometry combined with accurate molecular weight, metabolomics database, and literatures.-test: microwave fixation vs rotary continuous fixation: △:<0.05, △△:<0.01, microwave fixation vs steam fixation: #:<0.05，##:<0.01, rotary continuous fixation vs steam fixation: $:<0.05，$$:<0.01.

从表2中可以看出，杀青方式对黄酮糖苷含量具有较显著影响。相比于微波杀青和滚筒杀青夏季绿茶，蒸汽杀青样品具有较高含量的芹菜素糖苷类化合物（芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷、芹菜素-6,8-C-双葡糖苷），木犀草素糖苷类化合物（异荭草素、荭草素），槲皮素糖苷类化合物（异槲皮苷、槲皮素-3--葡萄糖酰芸香糖苷、槲皮素-3--半乳糖酰芸香糖苷、芦丁），山奈酚-3--葡萄糖苷（Astragalin），以及山奈酚-3--葡萄糖酰芸香糖苷。相比于微波杀青样品，蒸汽杀青和滚筒杀青样品具有较高含量的山奈酚及山奈酚糖苷化合物（山奈酚-3--半乳糖苷、山奈酚-3--半乳糖酰芸香糖苷、对香豆酰黄芪苷）和牡荆素-2--鼠李糖苷。

2.1.4 杀青方式对氨基酸含量的影响

从表2可以看出，杀青方式对绿茶中氨基酸含量具有较大影响：茶氨酸含量，微波杀青＞蒸汽杀青＞滚筒杀青；谷氨酸含量，蒸汽杀青＞微波杀青＞滚筒杀青；天冬氨酸含量，蒸汽杀青＞滚筒杀青、微波杀青；天冬酰胺含量，蒸汽杀青＞微波杀青、滚筒杀青，滚筒杀青与微波杀青样品间无显著差异。

2.1.5 杀青方式对原花青素、聚酯型儿茶素、 酚酸类物质含量的影响

从表2可以看出，蒸汽杀青的夏季绿茶样品中原花青素（原花青素B1和原花青素C1）、聚酯型儿茶素（聚酯型儿茶素A、聚酯型儿茶素B和聚酯型儿茶素C）和茶没食子素含量显著高于滚筒杀青和微波杀青的样品。蒸汽杀青和滚筒杀青的夏季绿茶咖啡酸和香豆酸含量显著高于微波杀青样品，但蒸汽杀青和滚筒杀青间不存在显著差异。

2.2 杀青方式对夏季绿茶滋味品质的影响

通过与谷氨酸钠、咖啡碱和EGCG系列标准溶液相比较，3种杀青方式处理后的夏季绿茶鲜味、苦味和涩味量化得分如表3所示。杀青方式可以较明显地改变夏季绿茶的滋味：苦味强度，滚筒杀青>蒸汽杀青>微波杀青；涩味强度，蒸汽杀青>滚筒杀青>微波杀青；鲜味得分上，微波杀青>滚筒杀青>蒸汽杀青，但鲜味在这3种杀青方式之间无统计学显著差异。

研究[10]表明，茶叶中的苦味和涩味物质主要包括酚酸、儿茶素及其氧化产物、黄酮糖苷及原花青素等。为进一步研究由杀青方式引起的与绿茶滋味变化相关的化合物，本研究中利用SPSS软件将滋味量化结果与化合物测定结果进行相关性分析，筛选出与苦、涩、鲜味相关性较强的化合物，并利用Cytoscape软件绘制相关性网络图（图2）。从图中可以看出，与苦味呈强正相关的物质主要包括黄酮糖苷、儿茶素和有机酸；与涩味呈强正相关的物质主要包括儿茶素、原花青素、聚酯型儿茶素、黄酮糖苷和有机酸；这些与苦味和涩味呈强正相关的物质普遍与鲜味呈强负相关关系。茶汤中

这几类物质可能对苦味和涩味的贡献率较高，不同杀青方式可能通过影响这些物质的含量来影响茶汤的苦味和涩味。

结合以上图表可以看出，苦味相关物质（如咖啡酸、香豆酸、山柰酚等）在微波杀青夏季绿茶中的含量显著低于滚筒杀青与蒸汽杀青夏季绿茶，而在滚筒杀青夏季绿茶中的含量与蒸汽杀青夏季绿茶不存在显著差异，该结果与苦味量化评分（滚筒杀青和蒸汽杀青夏季绿茶的苦味得分高于蒸汽杀青夏季绿茶，但滚筒杀青和蒸汽杀青夏季绿茶苦味得分之间无统计学差异）一致。涩味相关物质（如儿茶素、聚酯型儿茶素、原花青素等）在蒸汽杀青夏季绿茶中的含量均显著高于滚筒杀青和微波杀青夏季绿茶，且大多数涩味相关物质在滚筒杀青夏季绿茶中的含量高于微波杀青夏季绿茶，此结果与涩味量化评分结果（蒸汽杀青＞滚筒杀青＞微波杀青）一致。从表3中还可以看出，在本实验条件下，3种杀青方式对以夏季龙井43鲜叶为原料制作的夏季绿茶鲜味无明显影响。

3 讨论

不同杀青方式对绿茶整体化学成分的影响及其与滋味品质的相关性目前研究较少。本实验基于UPLC-Q-TOF/MS的理化成分分析和统计分析结果表明，蒸汽杀青、滚筒杀青、微波杀青对夏季绿茶中的儿茶素、黄酮糖苷、原花青素、聚酯型儿茶素、氨基酸、酚酸和有机酸等化学成分含量具有明显的影响（表2，图2）。滋味（鲜味、苦味、涩味）等效量化评分结果表明，杀青方式对夏季绿茶滋味品质的影响主要表现为：滚筒杀青>蒸汽杀青>微波杀青（苦味强度）；蒸汽杀青>滚筒杀青>微波杀青（涩味强度）；鲜味得分上，微波杀青>滚筒杀青>蒸汽杀青，但三者之间无统计学显著差异。夏季绿茶茶多酚含量较高，氨基酸含量低，主要呈现苦味和涩味，鲜味相对较弱[12]，因此本研究着重分析了这3种杀青方式对夏季绿茶苦味和涩味的影响，并对与苦味和涩味相关性较强的化合物含量变化作了详细讨论。蒸汽杀青夏季绿茶涩味最强，可能是由于蒸汽杀青时间较短，儿茶素尤其是酯型儿茶素减少量相对较少，蛋白水解产物氨基酸的增加量也相对较少，造成酚氨比值较高，因此入口比较苦涩[4,6]。另外，蒸汽杀青绿茶中含量较高的黄酮糖苷[11]、聚酯型儿茶素、原花青素也会在一定程度上增强茶汤的涩味。滚筒杀青夏季绿茶苦味最强，这可能是因为与苦味呈强正相关关系的一些黄酮糖苷[4]、酚酸，以及儿茶素（如EC、GC）保留量较多，而与茶汤苦味呈强负相关关系的氨基酸（如茶氨酸、谷氨酸）等含量较少，导致其苦味相对较强。

本研究中，根据质谱相对定量结果对蒸汽杀青、滚筒杀青、微波杀青处理的夏季绿茶化学成分及滋味品质进行了研究，对于了解杀青方式对绿茶关键滋味化学成分的影响具有重要的意义。在后续研究中，我们将进一步分析绿茶关键滋味物质之间的呈味互作关系，从而更为深入地探索杀青方式对夏季绿茶中化学成分及滋味品质的影响。

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Study on the Effects of the Fixation Methods on the Chemical Components and Taste Quality of Summer Green Tea

QI Dandan1,2, DAI Weidong1, TAN Junfeng1, PENG Qunhua1, ZHANG Yue1, LIN Zhi1*

1. Key Laboratory of Tea Biology and Resource Utilization of Ministry of Agriculture, Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

As a key processing craft, fixation plays a key role in the formation of green tea quality. To study the effects of fixation methods on the summer green teas, a method based on ultra high performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF/MS) combined with equivalent-quantification of the tea taste, in which caffeine, epigallocatechin gallate and sodium glutamate were used as bitter, astringent, and umami reference, respectively, was applied to investigate the difference of the chemical components and taste quality in summer green teas made by microwave fixation, rotary continuous fixation and steam fixation, respectively. Results of LC-MS analysis demonstrated that the contents of catechins, flavonol/flavone glycosides, procyanidins, theasinesins, amino acids, phenolic acids, and organic acids were significantly influenced by the fixation methods. Equivalent-quantification of the tea taste (umami, bitterness and astringency) also showed that fixation methods could change the taste quality of the summer green teas: the bitterness was higher in the green teas produced by rotary continuous fixation than by steam fixation then by microwave fixation; the astringency was

higher in the green tea produced by steam fixation than by rotary continuous fixation then by microwave fixation; the umami scores did not exhibited statistical differences among these three groups of tea.

summer green teas, fixation methods, taste, chemical components, LC-MS

TS272.5+1；TS272.4

A

1000-369X（2016）01-018-09

2015-07-02

2015-09-19

中国农业科学院创新工程（CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS）、现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-23）。

祁丹丹，女，硕士研究生，主要从事茶叶加工品质化学研究。*通讯作者：linz@tricaas.com