LC-MS/MS法测定食用油中的辣椒素和二氢辣椒素

梁桂娟，寻思颖，张　琼，李红洲

LC-MS/MS法测定食用油中的辣椒素和二氢辣椒素

梁桂娟，寻思颖*，张琼，李红洲

（贵州省产品质量监督检验院，贵州 贵阳 550016）

建立了用氨基固相萃取小柱净化提取液，液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）法测定食用油中辣椒素和二氢辣椒素含量的检测方法。结果表明，辣椒素在0～100 ng/mL范围内线性关系良好（R2=0.998 6），平均回收率在70.6%～90.5%，相对标准偏差（RSD，n=3）在3.1%～8.9%，检出限为0.03 μg/kg；二氢辣椒素在0～20 ng/mL范围内线性关系良好（R2=0.998 8），平均回收率在71.5%～100.7%，相对标准偏差（RSD，n=3）在6.0%～13.2%，检出限为0.006 μg/kg。该方法简便快速、准确可靠，是鉴别地沟油和测定食用油中辣椒素类物质的有效方法。

固相萃取；液相色谱串联质谱；食用油；辣椒素；二氢辣椒素

正常食用油中几乎不含辣椒素类物质，但一些不法商贩为获取暴利，把地沟油添加到正常食用油中，以假乱真。地沟油是各类废弃劣质油脂的统称［1］，其中来自餐饮业的泔水油是其主要成分，也包括煎炸废油、食品及相关企业产生的废弃油脂等。地沟油含有多种有害成分，长期食用易对人体产生巨大的伤害［2］，其鉴别及有效的检测方法已成为我国食品安全领域亟须解决的问题。由于我国居民的饮食习惯，辣椒是餐饮业中使用量较大的调味料，而辣椒的主要辣味成分是天然辣椒碱，该物质由14种辣椒素同位素组成，其中辣椒素和二氢辣椒素的总含量占辣椒碱的90%以上［3］。辣椒素类物质具有脂溶性强、稳定性好、沸点高等特点，目前的地沟油加工工艺很难完全除去这类物质，而接触过辣椒的餐厨废弃油脂几乎难免含有这种成分，因此可将辣椒素类物质作为鉴别餐厨废弃油脂的特征指标［4-6］。

我国国家标准［7-9］中及文献方法［10］检测辣椒素类物质的方法主要是高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）和分光光度法，适用于辣椒或以辣椒为主要原料的辣椒制品进行常量或微量的定量检测，检出量一般为g/kg级，最低检出限均为mg/kg。由于地沟油在经过水洗、蒸馏、脱色、除臭等加工处理，且不法商贩将之以一定比例渗入正常食用油后，大大降低了油脂中残留的辣椒素类物质的含量，因此常量检测方法很难将其检测出来。文献报道了几种用高效液相色谱-串联质谱（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）检测油脂中辣椒素类物质的方法［11-15］，检出限均能达到μg/kg级甚至ng/kg级，用于地沟油的鉴别分析，均取得了良好效果。王龙星等［11-12］利用辣椒素类物质含有酚羟基的特征，先用碱液萃取油脂中的辣椒素类物质，再将萃取液过HLB固相萃取小柱进行净化，该方法能有效除去油脂基质，但操作过程较为繁琐耗时，实验结果稳定性不理想。张忠等［13］用甲醇提取油脂中的辣椒素类物质后直接进液质联用仪进行检测，虽然简单快速，但不能有效除去油脂基质，容易污染仪器，且检出限较高。赵琴等［14］采用Benzo I填料作为吸附剂，利用辣椒素类物质结构中含有极性较强的酚羟基和酰胺基团，在非极性环境中能保留在吸附剂上的特点，一步净化提取液，不仅能有效除去油脂基质，且操作简便易行，但装填吸附剂费时费力，且是否装填均匀对实验结果影响很大，不适合大批量的样品检测。

本实验在参考相关文献及反复实验的基础上，采用高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS）法测定食用油中辣椒素和二氢辣椒素含量，选择具有极性固定相和弱阴离子交换剂双重作用的硅胶氨基萃取柱Classic-NH2作为固相萃取小柱净化提取液，用甲醇洗脱目标物及空白基质加标溶液配制标准曲线并用二苯胺做内标，以补偿基质效应及校正仪器波动引起的测定误差。该方法的建立，将有效提升检测辣椒素和二氢辣椒素的技术水平，为地沟油的综合判定提供可靠的技术保证。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

色拉油：市售；辣椒素标准品（纯度＞98%，分子式C18H27NO3，CAS号：404-86-4）：南京多隆生物科技有限公司；二氢辣椒素（纯度＞98%，分子式C18H29NO3，CAS号：19408-84-5）：上海樊克生物科技有限公司；二苯胺标准品（纯度＞99%，分子式C12H11N，CAS：122-39-4）：上海常斤生物科技有限公司；0.22 μL有机滤膜：上海泽孚实业有限公司。

甲醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷（均为分析纯）：天津市津东天正精细化学试剂厂；甲醇、甲酸（色谱纯）：美国默克公司；Classic-NH2阴离子交换固相萃取小柱（规格1 000 mg/6 mL）：德国Simon Aldrich公司，使用前用5 mL甲醇、3 mL丙酮和3 mL正已烷依次活化。

1.2仪器与设备

YP202N型电子天平（感量0.01 g）：上海精密科学仪器有限公司；AB4000Qtrap液质联用仪（带Agilent1260高效液相色谱仪）：美国AB公司；Mnltireax振荡混匀器：Heielolph公司；TurboVap氮吹仪：美国Biotage公司；固相萃取装置：美国Agilent公司。DSY-Ⅲ氮吹仪：北京金科精华苑科技有限公司；90-2磁力搅拌器：上海振荣科学仪器有限公司；QL-901漩涡混合器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.3方法

1.3.1质谱条件

根据辣椒素、二氢辣椒素及二苯胺的结构特征，选择ESI（+）正离子电离模式。通过对几种物质的标准溶液进行一级质谱全扫描和二级质谱扫描，优化锥孔电压、碰撞能量和其他参数，最终确定优化后的质谱参数为：雾化温度650℃；气帘气（氮气）流量：35 L/h；喷雾电压500 V；雾化气流量60 L/h；辅助气流量60 L/h；多反应监测（multiplereaction monitoring，MRM）模式质谱参数见表1。

表1　辣椒素、二氢辣椒素及二苯胺的质谱参数Table 1 Mass spectra parameters of capsaicin，dihydrocapsaicin and diphenylamine

1.3.2高效液相色谱条件

Agilent SB C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，4.6 μm）；流速0.8 mL/min；柱温为30℃；进样量为10 μL；流动相为0.1%甲酸水溶液和甲醇溶液梯度洗脱，洗脱梯度程序见表2。

表2　流动相梯度洗脱参数Table 2 Gradient elution parameters of mobile phase

1.3.3样品前处理

提取：称取2.5 g样品（精确至0.01 g），加入10 mL正己烷，在涡旋混匀器上充分混匀后作为上样液待净化。

净化：将上样液全部吸入经活化后的固相萃取小柱，残留样液用正己烷清洗后并入固相萃取小柱，流速不超过1.0 mL/min。上样液全部过柱后，先用5 mL含体积分数为20%乙酸乙酯的正己烷溶液淋洗小柱，再用5～10 mL含体积分数为80%乙酸乙酯的正己烷溶液淋洗，抽干淋洗液，用4 mL甲醇溶液洗脱，洗脱液用氮吹仪于40℃条件下吹干，最后用1 mL质量浓度为5 μg/L的二苯胺甲醇溶液充分涡旋混匀，过0.22 μm微孔有机滤膜供高效液相色谱-质谱联用仪测定。

1.3.4标准溶液的制备

（1）辣椒素和二氢辣椒素标准储备液

准确称取0.1 g（精确至0.000 1 g）辣椒素标准品和二氢辣椒素标准品，用甲醇溶解后定容至100 mL，配制成1 mg/mL的标准储备溶液，于-20℃条件下保存。

（2）二苯胺内标储备液

准确称取10 mg二苯胺标准品，用甲醇溶解后定容至100mL，配制成100μg/mL的内标储备溶液，于-20℃条件下保存。临用时用甲醇稀释成质量浓度为5μg/L的内标使用液。

（3）混合标准使用溶液的配制

移取不同体积的辣椒素、二氢辣椒素和二苯胺储备液，用甲醇配制成辣椒素质量浓度为0.1 μg/L、0.5 μg/L、2.5μg/L、10.0μg/L、25.0μg/L、50.0 μg/L、100.0μg/L，二氢辣椒素质量浓度为0.02 μg/L、0.10 μg/L、0.50 μg/L、2.00 μg/L、5.00 μg/L、10.00 μg/L、20.00 μg/L，二苯胺质量浓度为5 μg/L的混合标准使用溶液。

（4）空白基质混合标准使用液

分别称取与待测样品基质相同的、不含所测辣椒素和二氢辣椒素的阴性油脂样品7份于50 mL具塞离心管中。经过样液提取和净化步骤，分别加入1 mL混合标准使用溶液，涡旋混匀，配制成上述质量浓度的空白基质混合标准系列使用液。

1.3.5定性定量方法

1.4.2 治疗因素：治疗有效是支持诊断的重要依据。而诊断性治疗(试验性治疗)更是鉴别诊断的常用方法。但即使治疗方案是合理的，疗效也不可能百分之百。而治疗引起的不良反应以及药物对症状体征和辅助检查结果的影响都会干扰诊断[3]。

本方法用保留时间及离子对对目标化合物进行定性，二苯胺内标法定量。其中，标准溶液与待测溶液的保留时间偏差在2.5%以内。

2　结果与分析

2.1样品前处理方法

2.1.1提取及净化方法

采用正己烷溶解油脂，直接上Classic-NH2柱进行净化。Classic-NH2是一种以硅胶为基质的氨基萃取柱。它具有极性固定相和弱阴离子交换剂，可通过弱阴离子交换（水溶液）或极性吸附（非极性有机溶液）达到保留作用，具有双重作用。当用在非极性溶液中（如正已烷）进行预处理时，它能与带有-OH、-NH、-SH官能团的分子形成氢键。辣椒素和二氢辣椒素具有较强的脂溶性，易溶于正己烷等非极性有机溶剂，同时分子结构中含有酚羟基和酰胺基等极性基团，可以保留在Classic-NH2柱上，因此，用正己烷溶解含有辣椒素类物质的油脂时，可形成稳定均匀的非极性有机溶液，当溶液流过Classic-NH2时，含有-OH、-NH的辣椒素类物质保留在柱上，而油脂及其余杂质则流出小柱，用不同体积分数的乙酸乙酯正己烷溶液充分淋洗残留在柱上的残留油脂和其他杂质后，再用甲醇洗脱保留在柱上的辣椒素和二氢辣椒素，浓缩后进行检测。这种前处理方法利用辣椒素类物质结构上的特点，可一步提取进行净化，大大提高了回收率，而且节约了有机溶剂的使用量，缩短了检测时间。此外，由于无需装填净化小柱，保证了填料的均匀性，因此提高了检测结果的稳定性。

2.1.2淋洗溶液及洗脱液的选择

为使上机样液尽可能干净，减少基质效应和对仪器的污染，本实验用不同体积分数的乙酸乙酯正己烷溶液淋洗上样后的小柱。实验发现，乙酸乙酯体积分数越高，越容易洗净残留在柱上的油脂，考虑到乙酸乙酯对辣椒素类物质有一定的洗脱作用［14］，最终选择用含乙酸乙酯体积分数分别为20%和80%的正己烷溶液各5 mL依次淋洗。

用常用的两种洗脱试剂甲醇和乙腈进行实验，发现用甲醇作洗脱剂时，辣椒素和二氢辣椒素的洗脱率均高于乙腈，这可能是因为辣椒素类物质主要是通过氢键作用保留在固相萃取小柱上，而甲醇的分子结构中含有-OH，根据相似相溶原理，因此甲醇更容易洗脱目标物质。

2.2定量方法及内标的选择

在色谱-质谱分析中，由于基质效应的影响，目标物在纯溶剂和样品处理液中的响应有较大差异，同时，在前处理过程中目标物会有不同程度的损失。为更真实地反映实际样品中目标物的含量，一般会在样品中加入该目标物的同位素内标进行校正及补偿。但辣椒素及二氢辣椒素的内标物较昂贵，检测成本高，不利于方法的普及。因此，本实验采用空白基质加标的方式配制标准曲线，并用保留时间与二者接近的二苯胺作内标，以校正仪器波动实验引起的误差。结果表明，用这种方法进行定量，回收率及实测结果均有明显提高。

2.3方法学考察

2.3.1线性方程、相关系数及检出限

对空白基质混合标准系列溶液进样测定，以峰面积（y）为纵坐标，辣椒素和二氢辣椒素含量（x）为横坐标进行线性回归，得标准线性回归方程和相关系数。以信噪比3∶1计算检出限，得辣椒素和二氢辣椒素的最低检测质量浓度分别为0.076 μg/L和0.015 μg/L，按本实验中的取样量和定容体积计算，则样品中的检出限分别为0.03 μg/kg和0.006 μg/kg。线性范围、回归方程、相关系数和检出限（detection limit，LOD）见表3，添加目标物的油脂样品的MRM色谱及质谱图见图1～图3。

表3　方法的线性参数、检出限Table 3 Linear parameters and detection limit of the method

图1　辣椒素、二氢辣椒素、二苯胺的LC-MS/MS色谱图Fig.1 LC-MS/MS chromatogram of capsaicin，dihydrocapsaicin and diphenylamine

图2　辣椒素MRM的色谱图（A）及质谱图（B）Fig.2 MRM chromatogram（A）and mass spectra（B）of capsaicin

图3　二氢辣椒素MRM的色谱图（A）及质谱图（B）Fig.3 MRM chromatogram（A）and mass spectra（B）of dihydrocapsaicin

2.3.2回收率实验

在空白油脂样品中添加低（辣椒素和二氢辣椒素分别为0.25 μg/kg和0.05 μg/kg）、中（辣椒素和二氢辣椒素分别为2.5 μg/kg和0.5 μg/kg）、高（辣椒素和二氢辣椒素分别为25 μg/kg和5 μg/kg）三个浓度的目标分析物，每个浓度平行测定3次，进行加标回收实验，结果见表4。

表4　加标回收率实验结果Table 4 Results of standard recovery rate experiments

由表4可知，辣椒素的平均回收率在70.6%～90.5%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）在3.1%～8.9%，二氢辣椒素的平均回收率在71.5%～100.7%，相对标准偏差（RSD）在6.0%～13.2%，表明本方法准确性好。

2.3.3重现性实验

由两名检测人员在不同时间测定同一加标样品，辣椒素加标量为1.0 μg/kg，二氢辣椒素加标量为0.2 μg/kg，每人重复测定3次，考察该方法的重现性，结果见表5。

由表5可知，重现性实验结果RSD在3.5%～6.8%，表明重现性良好，方法稳定。

2.4样品的测定

表6　食用油中辣椒素和二氢辣椒素的检测结果Table 6 Detection results of capsaicin and dihydrocapsaicin in edible oil

用本方法对市场上6种知名品牌各类食用油进行检测，均未检出辣椒素及二氢辣椒素。为验证方法的适用性，在上述食用油中加入已知辣椒素和二氢辣椒素含量分别为1.92 mg/kg和0.73 mg/kg的辣椒油，以5∶95的比例混匀后按本方法检测，结果（见表6）可知，实测值与理论值标准偏差在4.5%～16.6%，说明本方法具有较好的适用性。

3　结论

本研究建立了固相萃取-液质联用法测定食用油中辣椒素和二氢辣椒素含量的方法。样品用正己烷溶解后，上Classic-NH2硅胶氨基固相萃取小柱净化，最后用液质联用仪对样液中的辣椒素和二氢辣椒素进行检测。结果表明，辣椒素在0～100 ng/mL范围内线性关系良好（R2=0.998 6）平均回收率在70.6%～90.5%，相对标准偏差（RSD，n=3）在3.1%～8.9%，检出限为0.03μg/kg；二氢辣椒素在0～20ng/mL范围内线性关系良好（R2=0.998 8），平均回收率在71.5%～100.7%，相对标准偏差（RSD，n=3）在6.0%～13.2%，检出限为0.006 μg/kg。本方法操作简便快速、准确可靠、适用性好，检出限可达ng/kg级，是鉴别地沟油或食用油中是否渗杂地沟油的有效方法。

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Determination of capsaicin and dihydrocapsaicin in edible oil by LC-MS/MS

LIANG Guijuan，XUN Siying*，ZHANG Qiong，LI Hongzhou
（Guizhou Institute of Product Quality Supervision and Determination，Guiyang 550016，China）

A method was established for the determination of capsaicin and dihydrocapsaicin in edible oil by solid phase extraction and LC-MS/MS. Theresultsindicatedthatthecapsaicinshowedgoodlinearrelationshipintherangeof 0-100ng/ml（R2=0.9986），theaveragerecoverywas70.6%-90.5%，and relative standard deviation（RSD，n=3）was 3.1%-8.9%，and the detection limit was 0.03 μg/kg.The dihydrocapsaicin showed good linear relationship in the range of 0-20 ng/ml（R2=0.998 8），the average recovery was 71.5%-100.7%，relative standard deviation（RSD，n=3）was 6.0%-13.2%，and the detection limit was 0.006 μg/kg.The method was simple，rapid，accurate and reliable，and it was an effective method for the identification of waste oil and determination of capsaicin in edible oil.

solid phase extraction；LC-MS/MS；edible oil；capsaicin；dihydrocapsaicin

O657.72

0254-5071（2016）07-0175-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.038

2016-05-24

贵州辣椒技术标准体系（黔卫计办函［2015］94号）

梁桂娟（1972-），女，高级工程师，硕士，研究方向为食品分析与检测。

寻思颖（1963-），女，研究员，本科，研究方向为食品安全风险评价。