亚硒酸钠对薇菜发酵中亚硝酸盐含量的影响

谷　云，祁勇刚，，张义杰，高　冰

亚硒酸钠对薇菜发酵中亚硝酸盐含量的影响

谷云1，祁勇刚1，2，张义杰3，高冰2*

（1.武汉市鑫宏食品酿造科研所，湖北 武汉 430051；2.湖北工业大学 食品与制药工程学院，湖北 武汉 430068；3.湖北省食品质量安全监督检验研究院，湖北 武汉 430000）

该试验研究了亚硒酸钠对薇菜发酵过程中亚硝酸盐含量的影响。分别添加亚硒酸钠于自然发酵和接种发酵的薇菜，发现亚硒酸钠可以降低“亚硝峰”；接种发酵薇菜，“亚硝峰”比自然发酵的低，且提前1 d出现，发酵8 d时，亚硝酸盐和硝酸盐含量皆比自然发酵的低。以接种发酵结束后的亚硝酸盐含量为评价指标，确定了发酵薇菜中亚硒酸钠的适宜添加量为0.3 g/L。通过添加Na2CO3维持发酵薇菜的pH值为5.0，发酵薇菜的“亚硝峰”提前1 d出现，且发酵结束时亚硝酸盐含量由自然pH时的2.16 mg/kg降为0。亚硒酸钠分3次添加，每次0.10 g/L时，“亚硝峰”提前至发酵3 d时出现，且添加次数增多时，发酵结束时亚硝酸盐含量也由一次性添加时的1.26 mg/kg降低到0.34 mg/kg，而硝酸盐也由0.13 g/kg降低到0.032 g/kg。

薇菜；亚硒酸钠；发酵；亚硝酸盐；亚硝峰

薇菜（Osmunda japonica），是一种经济价值比较高的蕨类植物，具有很高的营养价值和保健功能，被国内外营养学家称为绿色保健食品，成为深受国内外消费者欢迎的“山菜之王”和“山珍”［1-3］。但薇菜味苦涩，不宜直接食用，对薇菜的研究多集中在漂烫后即食的加工研究，而我国的薇菜大多也是直接漂烫或干制后，带水包装出口到东亚［4-7］。薇菜经过腌渍或发酵，不仅能去除其苦涩味，而且还能增添其香味。蔬菜腌制或发酵过程中都会产生一定量的亚硝酸盐，对人们的健康产生危害［8-13］。硒（Se）是机体必需的一种微量元素，具有抗氧化、增进人体免疫力、抗癌防癌以及延缓衰老等功效［14-15］。研究证实，机体对有机硒的利用率高于无机硒［16］。

亚硝酸盐含量过高是腌制蔬菜常见的问题，而亚硝酸盐能使血液中正常携氧的低铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，因而失去携氧能力而引起组织缺氧；亚硝酸盐同时还是一种致癌物质，据研究，食道癌与患者摄入的亚硝酸盐量呈正相关性，亚硝酸盐的致癌机理是：在胃酸等环境下亚硝酸盐与食物中的仲胺、叔胺和酰胺等反应生成强致癌物N-亚硝胺。亚硝胺还能够透过胎盘进入胎儿体内，对胎儿有致畸作用。为了探索亚硒酸钠对发酵薇菜中亚硝酸盐的影响，本试验对富硒发酵薇菜［17］的工艺进行了研究，研究了发酵薇菜中亚硝酸盐和硝酸盐含量的变化及消长关系，进而初步研究其对亚硝酸盐和硝酸盐的影响机理。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1材料

薇菜：由湖北长友现代农业股份有限公司提供；食盐：湖北盐业集团有限公司；亚硒酸钠（食品级）：河南宣源化工原料有限公司。

1.1.2试剂

葡萄糖、酵母膏、琼脂粉、蛋白胨、牛肉膏、吐温80、K2HPO4、MgSO4、亚硝酸钠、硝酸钠、Na2CO3（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3菌种

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）L1：由湖北工业大学食品与制药工程学院提供。

1.2仪器与设备

752S紫外可见分光光度计：上海棱光技术有限公司；镉柱：天长市金桥分析仪器厂；DS-1高速组织捣碎机：郑州南北仪器设备有限公司；HRN32手持折射仪：德国托摩根公司；SW-CJ-2D净化工作台：广州瑞智科学仪器有限公司；LHS-250SC型智能型恒温恒湿箱：上海浦东荣丰科学仪器有限公司；SLY-2112B型立式双层大容量恒温培养摇床：金坛市盛蓝仪器制造有限公司；YM系列A型立式压力蒸汽灭菌器：上海三申医疗器械有限公司；PHS-3C雷磁pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3方法

1.3.1薇菜发酵的工艺流程

1.3.2亚硒酸钠对自然发酵和接种发酵薇菜中亚硝酸盐的影响

将新鲜薇菜洗净，并剪去老梗，沥干，称取1 kg移至发酵坛；用纯净水配制成6%的食盐水1 kg，并加入亚硒酸钠0.2 g，混合均匀，一并加入到发酵坛中，封坛，22℃保温发酵8 d，自发酵开始测定亚硝酸盐和硝酸盐含量。试验重复3次，以不加亚硒酸钠作为对照。

同上述操作，加入植物乳杆菌L1种子液50 mL，代替50 mL食盐水，封坛，22℃保温发酵，自发酵开始测定亚硝酸盐和硝酸盐含量。试验重复3次，以不加亚硒酸钠作为对照。

1.3.3薇菜发酵中亚硒酸钠添加量的试验设计

将新鲜薇菜洗净，并剪去老梗，沥干，称取1 kg移至发酵坛；用纯净水配制成6%的食盐水1 kg，添加亚硒酸钠，混合均匀，加入到发酵坛中；加入植物乳杆菌L1种子液50 mL，封坛，22℃保温发酵8 d，作5个处理，编号分别为A、B、C、D、E，亚硒酸钠添加量分别为：0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L，自发酵开始测定亚硝酸盐含量。

1.3.4薇菜发酵中亚硝酸盐影响机理的初步研究

将新鲜薇菜洗净，并剪去老梗，沥干，称取1 kg，移至发酵坛；用纯净水配制成6%的食盐水1 kg，并加入亚硒酸钠0.3 g/L，混合均匀，一并加入到发酵坛中，加入植物乳杆菌L1种子液50 mL，封坛，22℃保温发酵8 d，通过添加Na2CO3使发酵液pH值维持在5.0左右，自发酵开始测定硝酸盐和亚硝酸盐含量，试验重复3次，以不加亚硒酸钠作为对照。考察亚硒酸钠对薇菜发酵中亚硝酸盐的影响是否为pH作用，若不是，则说明是酶作用。

1.3.5亚硒酸钠的添加次数对薇菜发酵中亚硝酸盐的影响

a.将新鲜薇菜洗净，并剪去老梗，沥干，称取1 kg移至发酵坛；用纯净水配制成6%的食盐水1 kg，并加入亚硒酸钠0.3 g/L，混合均匀，一并加入到发酵坛中，加入植物乳杆菌L1种子液50 mL，封坛，22℃保温发酵8 d，通过添加Na2CO3使发酵液pH值维持5.0，自发酵开始测定硝酸盐和亚硝酸盐含量，试验重复3次，作为对照组；b.操作同“a”，亚硒酸钠分2次添加，分别在发酵前和发酵3 d时，每次添加量0.15 g/L，试验重复3次；c.操作同“a”，亚硒酸钠分3次添加，分别在发酵前、发酵2 d和发酵4 d时，每次添加量0.1 g/L，自发酵开始测定硝酸盐和亚硝酸盐含量，试验重复3次。

按照最后确定的亚硒酸钠的添加量和添加次数，添加于接种植物乳杆菌L1的薇菜中，发酵结束后测定薇菜中硒的含量，试验重复3次。

1.3.6测定方法

硝酸盐和亚硝酸盐的测定：参照GB 5009.33—2010《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》；pH值测定：采用pH计测定；硒含量的测定：参照GB 5009.93—2010《食品安全国家标准食品中硒的测定》荧光法。

2　结果与分析

2.1亚硒酸钠对自然发酵和接种发酵薇菜中亚硝酸盐的影响结果

蔬菜在自然发酵初期，pH值＞5.5，细菌种类较多，随着发酵过程的进行，pH逐渐降低，一些不耐酸的菌株生长受到抑制，乳酸菌等产酸菌开始成为优势菌种，而此时亚硝酸盐含量也逐渐上升，直至达到峰值，之后又逐渐降低［19］。亚硒酸钠对自然发酵薇菜中硝酸盐和亚硝酸盐的影响结果如图1。

由图1可知，随着发酵的进行，硝酸盐含量逐步降低，而亚硝酸盐则先升高后降低，出现了“亚硝峰”；通过对照组的数据比较，添加了亚硒酸钠，同一发酵时间，硝酸盐含量更低，说明其降低的更快，同样，对于亚硝酸盐，其含量也比对照组低，“亚硝峰”出现的时间一致，但峰值更低，从31.1 mg/kg降低为28.5 mg/kg；发酵8 d时，添加亚硒酸钠使得薇菜中硝酸盐和亚硝酸盐含量更低。本实验在一定程度上说明，添加亚硒酸钠既可以降低硝酸盐含量，又可以降低亚硝酸盐的含量。

图1　亚硒酸钠对自然发酵薇菜中硝酸盐和亚硝酸盐含量的影响Fig.1 Effect of sodium selenite on nitrite and nitrate contents in the Osmunda japonicawith natural fermentation

亚硒酸钠对人工接种乳酸菌发酵薇菜中亚硝酸盐的影响见图2。由图2可知，人工接种发酵薇菜的“亚硝峰”提前1 d出现，并且峰值要比自然发酵的低，且发酵8 d时，硝酸盐和亚硝酸盐含量都要比自然发酵的低。原因可能是人工接种乳酸菌发酵制备发酵薇菜，可以使乳酸菌迅速成为优势菌，抑制杂菌的生长，缩短发酵周期，而亚硒酸钠的添加促进了乳酸菌的增殖和转化硝酸盐和亚硝酸盐的酶系分泌，从而促进硝酸盐和亚硝酸盐的转化与降解。

图2　亚硒酸钠对接种发酵薇菜中硝酸盐和亚硝酸盐含量的影响Fig.2 Effect of sodium selenite on nitrite and nitrate contents in the Osmunda japonicawith inoculated fermentation

2.2薇菜接种发酵中亚硒酸钠添加量的试验设计结果

薇菜接种发酵中亚硒酸钠的添加量对亚硝酸盐含量的影响见图3。从图3中可以看出，当亚硒酸钠的添加量为0.3 g/L时，接种发酵薇菜的“亚硝峰”最低，发酵结束后的亚硝酸盐含量稳定在2.17 mg/kg左右，也是所有试验处理中值最低的；当其添加量为0.1 g/L和0.2 g/L时，“亚硝峰”较高，发酵结束后亚硝酸盐含量也较高；当亚硒酸钠的添加量为0.4 g/L、0.5 g/L时，“亚硝峰”又变大了，且其添加量为0.5 g/L时，“亚硝峰”晚1 d出现，且峰值更大，亚硝酸盐含量稳定时的值也变大。综上分析，薇菜接种发酵时亚硒酸钠的添加量为0.3 g/L时较合适。

图3　接种发酵薇菜中亚硒酸钠的添加量对亚硝酸盐含量的影响Fig.3 Effect of sodium selenite addition on nitrite contents in the Osmunda japonicawith inoculated fermentation

2.3薇菜发酵中亚硝酸盐影响机理的初步研究结果与分析

图4　pH对接种发酵薇菜中亚硝酸盐及硝酸盐含量的影响Fig.4 Effect of pH on nitrite and nitrate content in the Osmunda japonicawith inoculated fermentation

通过添加Na2CO3维持发酵液的pH值在5.0左右，研究了pH对薇菜发酵中亚硝酸盐及硝酸盐的影响，结果见图4。由图4可知，调节pH的薇菜发酵中“亚硝峰”明显比自然pH值的低，并且“亚硝峰”提前1 d出现，发酵结束后的亚硝酸盐含量在发酵第6天时低于检测限；对于硝酸盐，试验组也比对照组下降的快，发酵第5天时，其含量降低到0.04 g/kg，发酵第6天，含量低于检测限。综上可知，将pH值恒定在5.0左右，“亚硝峰”反而更低，而发酵结束后的亚硝酸盐和硝酸盐含量低于检测限。这说明低pH不仅不能促进亚硝酸盐的降解，反而阻止了其彻底降解，亚硝酸盐不是通过添加亚硒酸钠促进乳酸菌的快速增殖降低pH而更快的降解的，这可能是亚硒酸钠的添加促进了硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶的合成与分泌，而pH值为5.0时，更接近上述2种酶的最适pH值，进而促进了亚硝酸盐和硝酸盐的降解，因此乳酸菌对亚硝酸盐的降解主要以酶降解为主。

2.4亚硒酸钠的添加次数对薇菜接种发酵中亚硝酸盐的影响研究了亚硒酸钠添加量和添加次数对薇菜发酵中亚硝酸盐和硝酸盐含量的影响，结果见图5。

图5　亚硒酸钠的添加量与添加次数对接种发酵薇菜中亚硝酸盐（A）及硝酸盐（B）含量的影响Fig.5 Effect of sodium selenite addition and adding times on nitrite（A）and nitrate（B）contents in theOsmunda japonicawith inoculated fermentation

由图5可知，分2次添加亚硒酸钠，每次0.15 g/L，可以降低“亚硝峰”峰值，当分3次添加，每次0.1 g/L时，“亚硝峰”提前至发酵3 d时出现，且发酵结束时亚硝酸盐含量也逐渐降低，分别降低至1.26 mg/kg和0.34 mg/kg。可见，分次添加亚硒酸钠有助于降低亚硝酸盐含量。分2次或者3次添加亚硒酸钠对硝酸盐影响区别不大，其发酵结束时的含量也基本相近，为0.032 g/kg，但是比1次添加的发酵结束时的含量（0.13 g/kg）要低很多，因此亚硒酸钠分3次添加，每次0.1 g/L时，效果较适宜。按此添加方式制备的发酵薇菜中硒含量为25.8 μg/100 g（富硒薇菜硒含量≥15 μg/100g）。中国居民膳食营养素参考摄入量速查手册规定18岁以上成年人、孕妇和乳母每天最大摄入量为400 μg［18］、营养素参考值（nutrient reference values，NRV）建议量50 μg［19］，即发酵薇菜每天最大摄入量为1.55 kg、建议量为194 g。

3　结论

添加亚硒酸钠于自然发酵或接种发酵的薇菜中，均能促进薇菜中亚硝酸盐峰值的降低，且接种发酵薇菜的“亚硝峰”比自然发酵的提前1 d出现，峰值更低，且发酵8 d时，亚硝酸盐和硝酸盐含量也更低。

亚硒酸钠的添加能促进了硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶的合成与分泌，而pH值为5.0时，更接近上述2种酶的最适pH值，进而促进了亚硝酸盐和硝酸盐的降解。

多次少量添加能降低“亚硝峰”峰值，促进峰值提前出现，且使发酵薇菜成品中亚硝酸盐和硝酸盐含量处于较低值，而发酵薇菜中较低的硝酸盐含量，也消除了其大量转化为亚硝酸盐的隐患。亚硒酸钠最适添加量为0.3g/L（分3次添加，每次0.1 g/L），按此添加方式制备的发酵薇菜中硒含量为25.8 μg/100 g（富硒薇菜硒含量≥15 μg/100g）。

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Effect of sodium selenite on nitrite contents inOsmunda japonicafermentation

GU Yun1，QI Yonggang1，2，ZHANG Yijie3，GAO Bing2*
（1.Wuhan Xinhong Institute for Food Fermentation，Wuhan 430051，China；2.Collage of Food and Pharmaceutical Engineering，Huibei University of Technology，Wuhan 430068，China；3.Huibei Provincial Institute for Food Supervision and Test，Wuhan 430000，China）

The effect of sodium selenite on nitrite inOsmunda japonicafermentation was investigated.Sodium selenite could reduce nitrite-peak by adding it in theO.japonicawith natural and inoculated fermentation.The nitrite peak was lower than natural fermentation and appeared 1 d in advance in theO.japonicaby inoculated fermentation.When the fermentation was over at 8 d，nitrite and nitrate content of inoculatedO.japonicawere lower than that of natural fermentation.Using nitrite content after the end of the fermentation as evaluation index，results showed that the suitable sodium selenite was 0.3 g/L.Maintaining the pH 5.0 by adding Na2CO3in theO.japonicafermentation，nitrite-peak appeared 1 d in advance，then nitrite reduced from 2.16 mg/kg to 0 at the end of fermentation.When sodium selenite was added 0.10 g/L per time for three times，nitrite-peak appeared at 3 d，and then nitrite reduced from 1.26 mg/kg to 0.34 mg/kg，and nitrate reduced from 0.13 g/kg to 0.032 g/kg at the end of fermentation.

Osmunda japonica；sodium selenite；fermentation；nitrite；nitrite-peak

TS255.54

0254-5071（2016）07-0127-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.027

2016-03-20

武汉市产业创新服务平台项目（201220837301）

谷云（1987-），女，助理工程师，硕士，研究方向为食品发酵。

高冰（1963-），男，高级工程师，本科，研究方向为食品发酵工艺与设备。