灵芝液体发酵菌丝体中Agaricoglyceride A前体物质筛选

刘　艺，冯坤苗，狄志彪，张盼盼，韩春超，顾正位

灵芝液体发酵菌丝体中Agaricoglyceride A前体物质筛选

刘艺，冯坤苗，狄志彪，张盼盼，韩春超，顾正位*

（山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355）

在单因素试验的基础上，采用响应面分析法对灵芝液体发酵菌丝体中合成Agaricoglyceride A的前体物质（二氯茴香酸、甲醇、甘油）加入量进行优化，筛选提高Agaricoglyceride A含量的前体物质的最适添加量。并采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）法对Agaricoglyceride A含量进行检测。结果表明，同时加入二氯茴香酸75 mg/L，甲醇1.5 mL/L，甘油1.5 mL/L对灵芝进行发酵培养，测定得到AgaricoglycerideA的实际含量为21.09mg/L，与不添加任何前体物质相比，AgaricoglycerideA的含量提高了25.31%。

灵芝；发酵；前体物质；Agaricoglyceride A；响应面分析

灵芝（Ganoderma lucidum）始载于《神农本草经》，是一种珍贵的药食两用菌［1］，具有补气安神，止咳平喘的作用［2-3］。2015年版《中华人民共和国药典》将赤芝或紫芝的干燥子实体收入作为药材灵芝的来源［4］。目前对于灵芝的培育多采用液体深层发酵法［5-7］，得到的菌丝体周期短、成本低、质量稳定［8-10］。有研究表明，灵芝菌丝体中含有一种新型的真菌次生代谢物蘑菇酸甘油脂Agaricoglyceride A，其能够选择性地抑制溶神经素的活性，而该溶神经素对一些生物学上具有特殊活性（如镇痛）的肽类物质具有一定的灭活作用［11-13］，Agaricoglyceride A对溶神经素的选择性抑制能够增强这些肽类物质的镇痛等活性［14-15］，因此研究Agaricoglyceride A对于灵芝的有效利用和新药的开发具有重要意义和应用前景。

STADLER M等［15］对Agaricoglyceride A进行化学合成，利用氯化的4-羟基苯甲酸和丙三醇反应得到蘑菇酸甘油脂。除此之外，Stadler还对其加入不同前体物质进行生物合成后的Agaricoglyceride A含量进行了比较，发现加入合成酸和羟基苯甲酸均能提高Agaricoglyceride A的含量。在Agaricoglyceride A化学合成及其生物合成的基础上，本文加入前体物质二氯茴香酸、甘油及甲醇在灵芝液体发酵过程中进行生物合成，来提高Agaricoglyceride A的含量。前期研究发现，在不添加任何前体物质的情况下，灵芝液体发酵菌丝中Agaricoglyceride A的含量为16.83 mg/L。实验以二氯茴香酸、甘油及甲醇的加入量作为影响因子，灵芝液体发酵菌丝中Agaricoglyceride A的含量作为响应值，采用3因素3水平的Box-Behnken中心组合设计进行响应面法分析，为Agaricoglyceride A的开发提供理论依据和方法指导，同时为灵芝的深入研究提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌株

灵芝菌株：购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种保存在马铃薯琼脂培养基上，于4℃进行保存。

1.1.2对照品与试剂

Agaricoglyceride A对照品（纯度为96%）：中国科学院心理研究所；无水乙醇、乙酸乙酯（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；甘油（纯度为99.5%）、甲醇（纯度为99%）：天津富宇精细化工有限公司；乙腈（均为色谱纯）：美国天地公司；三氟乙酸：天津市科密欧化学试剂有限公司；二氯茴香酸：帝鑫化工制造有限公司。

1.1.3培养基

常规马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：土豆20%，琼脂2%，葡萄糖2%；

液体发酵培养基：土豆用量为21.79 g/100 mL，葡萄糖2.23 g/100 mL，麸皮用量为5.00 g/100 mL，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.15%。

1.2仪器与设备

YP100C2电子天平：上海天平仪器厂；YX-280D手提式压力蒸汽灭菌锅：宁波久兴医疗器械有限公司；ZHJHC1109B洁净工作台：深圳市碧海青云净化科技有限公司；XMTD-4000恒温培养箱：金坛市岸头良友实验仪器厂；HY-5A回旋振荡器：金坛市文华仪器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；XMTD-4000仪表恒温水浴锅、ZKXB-2电热真空干燥箱：上海树立仪器仪表有限公司；KQ-100B型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；Waters e2695型高效液相色谱仪、Waters 2424型蒸发光散射检测器：美国Waters有限公司。

1.3方法

1.3.1灵芝液体发酵菌丝中Agaricoglyceride A的含量测定

（1）Agaricoglyceride A供试品的制备

将发酵培养完成的灵芝用纱布过滤后获得菌丝，将其转移至不同的蒸发皿中，置于烘箱60℃干燥至质量恒定。干燥菌丝粉碎，过100目筛。加入10倍量无水乙醇160 W超声提取2次，3 000 r/min离心5 min后合并提取液，水浴60℃蒸干后加入一定量蒸馏水，用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液水浴蒸干后精密称定，用甲醇溶解定容至容量瓶中。

（2）Agaricoglyceride A对照品的制备

精密称取Agaricoglyceride A对照品25.00 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得1 mg/mL的对照品溶液。

（3）高效液相色谱条件

表1　梯度洗脱程序Table 1 The gradient eluted program

美国Waters e2695型高效液相色谱仪及Empower3工作站；检测器：Waters2424型蒸发光散射检测器（evaporative light scattering detector，ELSD）；色谱柱：Welch Ultimate XB-C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相A为0.1%三氟乙酸水，流动相B为乙腈；采用梯度洗脱，洗脱程序见表1。流速为1.0 mL/min；进样量：10 μL；ELSD参数：漂移管温度60℃，氮气流速25 mL/min，柱温30℃；运行时间60 min。

（4）标准曲线的绘制

分别精密吸取（2）项下对照品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，分别用色谱甲醇定容至10 mL容量瓶中，得质量浓度为0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、0.40mg/mL、0.50 mg/mL的对照品溶液，各取10 μL注入色谱仪中，按（1）项方法测定，记录峰面积。其质量浓度与峰面积的线性回归方程为Y=1.47X+6.3，R=0.999 3，在0.10～0.50 mg/mL内线性关系良好。

（5）高效液相色谱法测定Agaricoglyceride A的含量

取发酵菌丝样品，按（1）项方法制备供试品溶液，每种菌种平行制备3份，精密量取10μL进样，利用Agaricoglyceride A对照品的工作曲线Y=1.47X+6.3计算各样品中被测Agaricoglyceride A的质量浓度，每个样品测3次求平均值，最后计算每升发酵液中Agaricoglyceride A的含量。

1.3.2前体物质加入量单因素试验

采用液体发酵培养，进行前体物质加入量的单因素试验，研究Agaricoglyceride A合成前体物二氯茴香酸、甲醇、甘油的加入量对灵芝液体发酵中Agaricoglyceride A含量的影响。

（1）二氯茴香酸加入量单因素试验

在培养基中分别加入甲醇1 mL、甘油1 mL，再分别加入0、25 mg/L、50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L、125 mg/L的二氯茴香酸，根据“1.3.1”项下的方法测定Agaricoglyceride A的含量，各试验均进行3次重复处理。

（2）甲醇加入量单因素试验

在培养基中分别加入二氯茴香酸50 mg、甘油1 mL，再分别加入0、0.5mL/L、1.0mL/L、1.5mL/L、2.0 mL/L、2.5mL/L的甲醇，根据“1.3.1”项下的方法测定Agaricoglyceride A的含量，各试验均进行3次重复处理。

（3）甘油加入量单因素试验

在培养基中分别加入二氯茴香酸50 mg、甲醇1 mL，再分别加入0、0.5mL/L、1.0mL/L、1.5mL/L、2.0mL/L、2.5mL/L的甘油，根据“1.3.1”项下的方法测定Agaricoglyceride A的含量，各试验均进行3次重复处理。

1.3.3 Agaricoglyceride A前体物质加入量响应面优化

根据响应面优化分析法中Box-Behnken中心组合设计的原理，综合单因素试验的结果，采用Design-Expert（version8.0.6.1）分析软件设计并进一步进行3因素3水平的响应面分析试验，试验因子和水平见表2，优化试验以发酵菌丝中Agaricoglyceride A的含量作为考察指标，来确定各个因素对灵芝液体发酵菌丝中Agaricoglyceride A含量影响的显著性及各前体物质的最佳加入量。

表2　响应面试验因素水平及编码Table 2 Factors and coded levels of response surface methodology

1.3.4数据处理

采用响应面分析软件Design-Expert（version 8.0.6.1）对本试验数据进行多元二次回归模拟方程的建立及相关方差分析，并对模拟方程所代表的响应面进行分析。

2　结果与分析

2.1 Agaricoglyceride A前体物质加入量单因素试验结果

2.1.1二氯茴香酸的加入量对AgaricoglycerideA含量的影响

二氯茴香酸的加入量对AgaricoglycerideA含量的影响如图1所示。由图1可知，随着二氯茴香酸加入量的增加，灵芝发酵菌丝中Agaricoglyceride A的含量也在逐渐增大，根据Agaricoglyceride A的结构分析考虑，可能二氯茴香酸是其合成的主要前体物质之一，故二氯茴香酸的加入量增加其AgaricoglycerideA的含量也相应增大。但是当二氯茴香酸的加入量超过75 mg/L时，Agaricoglyceride A的含量增幅很小，综合成本考虑，在优化试验中选择二氯茴香酸加入量在25～75mg/L范围内。

图1　二氯茴香酸加入量对Agaricoglyceride A含量的影响Fig.1 Effect of dichloro anisic acid addition on Agaricoglyceride A production

2.1.2甲醇加入量对Agaricoglyceride A含量的影响

甲醇的加入量对Agaricoglyceride A含量的影响如图2所示。随着甲醇加入量的增加，Agaricoglyceride A的含量先增大后减小，在甲醇加入量为1.0 mL/L时，达到最大值即18.03 mg/L，随后Agaricoglyceride A的含量逐渐降低。由图2可知，甲醇对灵芝液体发酵菌丝中Agaricoglyceride A含量的提高有一定促进作用，但甲醇的量过多反而会减少Agaricoglyceride A的含量。因此，在优化试验中选择甲醇加入量在0.5～1.5 mL/L范围内。

图2　甲醇加入量对Agaricoglyceride A含量的影响Fig.2 Effect of methanol addition on Agaricoglyceride A production

2.1.3甘油加入量对Agaricoglyceride A含量的影响

甘油的加入量对Agaricoglyceride A含量的影响如图3所示。随着甘油加入量的增加，Agaricoglyceride A的含量也逐渐增大。当甘油加入量达到1.0mL/L时，Agaricoglyceride A的含量达到最大为18.55 mg/L，而当甘油加入量继续加大后，Agaricoglyceride A的含量出现下降的趋势。考虑在灵芝液体发酵过程中，甘油的加入量过大会一定程度上抑制Agaricoglyceride A的合成。因此，在优化试验中选择甘油添加量为0.5～1.5 mL/L。

图3　甘油加入量对Agaricoglyceride A含量的影响Fig.3 Effect of glycerinum addition on Agaricoglyceride A production

2.2响应面优化试验结果

2.2.1试验设计与结果

根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，综合单因素试验的结果，以二氯茴香酸加入量（A）、甲醇加入量（B）和甘油加入量（C）作为影响因子，以灵芝发酵菌丝体中Agaricoglyceride A的含量（Y）作为响应值，并在单因素的试验基础上采用3因素3水平的响应面分析法进行优化，其试验方案及结果见表3。

表3　响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface methodology

2.2.2模拟方程的建立与方差分析

采用Design-Expert（version 8.0.6.1）分析软件对表3中的数据进行多项式拟合回归，建立多元二次响应面回归模型：Y=19.61+1.21A+0.22B+0.23C+0.11AB+0.17AC+0.19BC-0.14A2-0.22B2-0.061C2，各因素方差分析结果见表4。其中，回归方程中各变量对指标（响应值）影响的显著性，由F检验来判定，概率P（F＞Fα）的值越小（＜0.05），则其相应变量的显著程度就越高。由表4可见，各因素中一次项都是高度显著的（P＜0.01），因素A、B二次项对Agaricoglyceride A含量的影响有显著性影响（P＜0.05），而因素C的二次项对Agaricoglyceride A含量的影响不显著（P＞0.05），交互项BC对结果影响显著（P＜0.05）。该模型模拟的回归方程也显著（P＜0.000 1），失拟项不显著，并且该模型的决定系数R2= 0.994 1，调整决定系数RAdj2=0.986 4，则说明该模型与实际试验拟合程度较好，自变量与响应值之间线性关系显著，可以用于灵芝液体发酵菌丝体中Agaricoglyceride A含量的理论预测。

表4　灵芝发酵菌丝中Agaricoglyceride A含量方差分析结果Table 4 Variance analysis of Agaricoglyceride A production in Ganoderma lucidumliquid fermentation mycelium

2.2.3响应面分析

试验因素交互作用对响应值影响的响应面分析结果见图4。由图4可知，并非所有的因素都对AgaricoglycerideA的含量有显著性影响。由图4（A）可知，二氯茴香酸和甘油的加入量对灵芝发酵菌丝体中Agaricoglyceride A的含量影响最显著，且随着二氯茴香酸和甘油加入量的增加，AgaricoglycerideA的含量也随之增大。由图4（B）可知，随着二氯茴香酸加入量的增加，Agaricoglyceride A的含量也在逐渐增大，而当甲醇加入量增加时Agaricoglyceride A的含量变化不大。由图4（C）可知，说明甲醇和甘油加入量对Agaricoglyceride A的含量影响显著。经过软件分析，得到灵芝液体发酵菌丝体中Agaricoglyceride A的含量达到预测最大值为21.15 mg/L，此时其前体物质的最佳加入量分别是二氯茴香酸74.665 mg/L，甲醇1.504 mL/L，甘油1.498 mL/L。结合实际操作，最佳加入量调整为75 mg/L，甲醇1.5 mL/L，甘油1.5 mL/L。

图4　二氯茴香酸、甲醇、甘油添加量交互作用对Agaricoglyceride A含量影响的响应面和等高线Fig.4 Response surface plots and contour line of effect of dichloro anisic acid，methanol and glycerinum addition on Agaricoglyceride A production

2.2.4模型验证

通过软件分析，预测得到灵芝液体发酵菌丝体中Agaricoglyceride A含量最大为21.15 mg/L，为验证响应面分析法所得结果的可靠性，采用上述优化的前体物加入量（二氯茴香酸75 mg/L，甲醇1.5 mL/L，甘油1.5 mL/L）进行发酵培养，利用高效液相色谱法分析测定计算的AgaricoglycerideA的实际含量为21.09mg/L，结果见图5，与理论预测值相比，相对误差约为1%。因此，该响应面模型能够较好地来预测合成AgaricoglycerideA的前体物质加入量对灵芝液体发酵菌丝体中AgaricoglycerideA含量的影响。前期不添加任何前体物质进行灵芝的液体发酵，得到Agaricoglyceride A含量约为16.83mg/L，在该优化工艺下得到的菌丝与其相比，Agaricoglyceride A含量提高了25.31%，提高幅度较大，表明该条件下发酵灵芝菌丝体以增加Agaricoglyceride A含量是可行的。

图5　Agaricoglyceride A标准品（A）与灵芝样品（B）色谱图Fig.5 High performance liquid chromatography ofGanoderma lucidumstandard（A）and sample（B）

3　结论

本试验在单因素试验的基础上，采用响应面分析法对灵芝液体发酵菌丝体中合成Agaricoglyceride A的前体物质加入量进行优化，在最优条件下灵芝液体发酵菌丝体中Agaricoglyceride A的含量得到了提高。在菌种发酵期间，采用在发酵液中直接滴加前体可显著提高发酵效价，但前体物质的浓度、滴加时间、加入量均对发酵效价有一定的影响。为了进一步提高AgaricoglycerideA的产量，下一步需要研究前体物质的最优加入时间。近年来对Agaricoglyceride A药理活性的研究不断深入，其对溶神经素的选择性抑制作用也得到了证实，因此研究和开发Agaricoglyceride A对于灵芝的有效利用和新药的开发具有重要意义和应用前景。

［1］朱强，夏艳秋，汪志君，等.4种中药对灵芝生长与发酵的影响［J］.中国酿造，2010，29（7）：163-165.

［2］倪宗耀.食用菌的食疗作用与保健疗效［J］.食药用菌，2013，21（1）：22-25.

［3］何晋浙，邵平，倪惠东，等.灵芝多糖结构及其组成研究［J］.光谱学与光谱分析，2010，30（1）：123-127.

［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京：中国医药科技出版社，2015：188.

［5］周连玉，刘明月，夏志兰，等.灵芝发酵液体种子培养条件研究［J］.食用菌学报，2005，12（4）：33-39.

［6］邱海龙，陈建伟，李祥，等.4种药用真菌发酵对番荔枝种子总内酯成分的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（4）：135-138.

［7］刘思妤，王艳，何蓉蓉，等.灵芝的化学成分［J］.沈阳药科大学学报，2008，25（3）：183-193.

［8］王伟.HPLC-ELSD法测定5种食用菌中agaricoglyceride A的含量［J］.中南药学，2015，13（7）：757-759.

［9］高玉荣，卢艳明.灵芝菌丝液体深层发酵培养基的研究［J］.中国酿造，2006，25（1）：18-20.

［10］朱强，夏艳秋，董克克，等.响应面法优化灵芝药性固体发酵培养基［J］.中国生物工程杂志，2010，30（9）：75-79.

［11］荆留萍，杜双田，金凌云，等.8种物质对蛹虫草液体发酵中虫草素及多糖含量的影响［J］.西北农林科技大学学报，2010，38（11）：156-160.

［12］文庭池，雷帮星，康冀川，等.添加前体促进蛹虫草发酵生产菌丝体和虫草菌素的研究［J］.食品与发酵工业，2009，35（8）：49-53.

［13］陈丽艳，杨晓旭，曹思思.灵芝菌发酵基质的条件优化及菌质活性物质的分析［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20（8）：106-109.

［14］YU H T，HAN C C，SUN Y，et al.The Agaricoglyceride of royal sun medicinal mushroom，agaricus brasiliensis（higher basidiomycetes）is anti-inflammatory and reverses diabetic glycemia in the liver of mice［J］. Int J Med Mushroom，2013，15（4）：357-364.

［15］STADLER M，HELLWIG V，MAYER-BARTSCHMID A，et al.Novel analgesic triglycerides from cultures ofAgaricus macrosporesand other Basidiomycetesas selective inhibitors of neurolysin［J］.J Antibiot，2005，58（12）：775-786.

Screening of Agaricoglyceride A precursor inGanoderma lucidumliquid-state fermentation mycelium

LIU Yi，FENG Kunmiao，DI Zhibiao，ZHANG Panpan，HAN Chunchao，GU Zhengwei*
（School of Pharmacy，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China）

On the basis of single factor experiment，the precursor of Agaricoglyceride A（dichloride anisic acid，methanol，glycerin）was added and the precursor addition was optimized inGanoderma lucidumliquid-state fermentation mycelium.Agaricoglyceride A content was detected by HPLCELSD.As a result，dichloride anisic acid 75 mg/L，methanol 1.5 ml/L and glycerin 1.5 ml/L was the optimal addition.The actual value of Agaricoglyceride A was 21.09 mg/L，which was increased by 25.31%compared with the one without any precursor addition.

Ganoderma lucidum；fermentation；precursor；Agaricoglyceride A；RSM

TQ920.6

0254-5071（2016）07-0045-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.010

2016-01-31

山东省重点研发计划（520864）

刘艺（1992-），女，硕士研究生，主要从事中药活性物质与新剂型研究工作。

顾正位（1979-），男，讲师，本科，主要从事中药活性物质与新剂型研究工作。