不同熏醅工艺条件对老陈醋中川芎嗪与丙烯酰胺含量的影响

李弘文，李晓慧，赵文良，杨小兰

不同熏醅工艺条件对老陈醋中川芎嗪与丙烯酰胺含量的影响

李弘文，李晓慧，赵文良，杨小兰*

（山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006）

研究了不同熏醅工艺（蒸汽熏醅及炭火熏醅）及不同参数（温度、时间）对醋醅熏制过程中川芎嗪和丙烯酰胺生成量的影响。结果表明，蒸汽熏醅比炭火熏醅能加快美拉德反应的速率；熏醅过程中生成的川芎嗪和丙烯酰胺生成量随着熏醅温度升高和时间延长而增加，但丙烯酰胺比川芎嗪需要更高的熏醅温度（100℃以上）才会生成；无论是蒸汽熏醅还是炭火熏醅，90℃熏醅至5 d均未检出丙烯酰胺，表明低温熏醅（90℃以下）有利于避免丙烯酰胺的生成，在低温熏醅的前提下，蒸汽熏醅比炭火熏醅既能避免丙烯酰胺的生成，又能显著提高川芎嗪的生成量和褐色度，因此低温蒸汽熏醅工艺更值得提倡推广。

蒸汽熏醅；炭火熏醅；川芎嗪；丙烯酰胺；高效液相色谱法

在我国，食醋的酿造工艺已有3 000多年的历史［1］，其已成为人们日常生活中不可缺少和替代的调味品。老陈醋产品质量标准GB/T 19777—2013《地理标志产品 山西老陈醋》［2］中新增加了川芎嗪指标，其作为保健功能成分，越来越受到人们的重视。川芎嗪又名四甲基吡嗪，不仅具有烘烤香气［3］，而且能治疗血瘀症、防治糖尿病，具有抗血栓、抗氧化、抗辐射、降压［4-6］等功能。川芎嗪在老陈醋熏醅阶段能大量产生［7-8］。此外，老陈醋的主要原料有高粱、豌豆和大麦等，其含有丰富的碳水化合物和蛋白质，这些物质在熏醅加热时不仅能产生川芎嗪，还可能会产生丙烯酰胺［6］，丙烯酰胺在1994年被国际癌症机构（international agency for research on cancer，IARC）归类为可疑的人类致癌物［4］，关于食醋中丙烯酰胺含量的研究少见报道。熏醅是酿醋过程中的一道重要工序［9］，传统的熏醅工艺是以地炕炭火80～90℃加热，每天依次人工倒缸翻醅，熏至5 d后出缸淋醋，但此工艺生产周期长，劳动强度大，而且明火熏醅会造成环境污染及安全隐患。因而近年来出现了新型的蒸汽熏醅工艺，该技术采用大型旋转式不锈钢夹层蒸汽熏醅罐，通过罐的旋转翻醅代替人工翻醅，不仅明显缩短熏醅时间、减少人力，而且有效地避免了使用明火的危险及污染问题。但此技术尚不成熟，确定工艺条件成为亟待解决的问题［10］。因此，本研究对不同熏醅工艺（蒸汽熏醅、炭火熏醅）及不同工艺条件（温度、时间）熏制醋醅过程中川芎嗪和丙烯酰胺的生成量进行了分析，为探索熏醅最佳的生产工艺条件提供理论依据，具有重要的现实意义。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

老陈醋熏醅样品：未熏醅（醋酸发酵成熟的醋醅）、炭火熏醅（90℃熏制1～5 d）、蒸汽熏醅（90℃熏制1～3 d，100℃熏制24 h，120℃熏制6～24 h），醋醅和熏醅设备均由山西某醋业公司提供。

丙烯酰胺标准品、盐酸川芎嗪标准品（分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、三氯甲烷（色谱级）：美国Fisher Scientific公司；纯净水：市售；浓盐酸、磷酸二氢铵、氢氧化钠等（均为分析纯）：太原市瑞佳科学器材有限公司。

1.2仪器与设备

高效液相色谱仪（high performance liquid chromatography，HPLC）（配有1525系列双泵系统、2487双波长UV检测器、Breeze软件操作系统）：美国Waters公司；Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱：上海康华生仪器制造厂；UV-2800AH紫外可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；Oasis HLB固相萃取柱（6cc，200 mg）：济南博纳生物技术有限公司。

1.3方法

1.3.1熏醅中川芎嗪的提取与含量测定

准确称取一定量熏醅，按料液比1∶20（g∶mL）加入蒸馏水，60℃加热超声40 min辅助提取川芎嗪，4 000 r/min离心30 min后得到的上清液为川芎嗪提取液。准确量取10.00 mL待测样品的川芎嗪提取液，用氢氧化钠溶液调pH＞8，移入分液漏斗中，分3次加入三氯甲烷，每次5 mL，充分混匀静置分层，收集合并三氯甲烷层。以0.2 mol/L盐酸分两次萃取三氯甲烷中的川芎嗪，每次4.5 mL，收集合并水相，用蒸馏水定容至10.00 mL。

参考国标GB/T 19777—2013《地理标志产品山西老陈醋》［2］中HPLC法并稍作改动，平行测定3次，取平均值。

川芎嗪含量计算公式如下：

式中：X为熏醅样品中川芎嗪的含量，μg/g醅；C为由标准曲线求得的样液中川芎嗪的质量浓度，μg/mL；v1为分析所取试样的体积，mL；v2为溶解样品的溶液的体积，mL；v3为试样最终定容体积，mL；m为熏醅样品的质量，g。

色谱条件：色谱柱Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为0.2 mmol/L磷酸二氢铵∶甲醇（60∶40，V/V）；流速0.4 mL/min；检测波长279 nm；柱温为室温；进样量10 μL。

1.3.2熏醅中丙烯酰胺的提取与含量测定

准确称取一定量熏醅，按料液比1∶20（g∶mL）加入蒸馏水室温提取丙烯酰胺，4 000 r/min离心30 min后得到上清液，用0.45 μm微孔滤膜过滤后，再经Oasis HLB固相萃取柱（使用前用5 mL甲醇和5 mL水活化）萃取富集丙烯酰胺，收集水洗脱液，即为丙烯酰胺提取液。

丙烯酰胺的测定采用HPLC法。结果以丙烯酰胺标准曲线定量，平行测定3次，取平均值，计算公式同1.3.1，以（μg/g醅）表示。色谱条件：色谱柱Diamonsil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇∶超纯水（10∶90，V/V）；流速0.4 mL/min；检测波长238 nm；柱温为室温；进样量10 μL。

标准曲线的绘制：称取丙烯酰胺标准品10 mg（精确至0.1 mg），以蒸馏水定容至100 mL，配成0.1 mg/mL丙烯酰胺标准液。分别以蒸馏水稀释配制成0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL和10.0 μg/mL，利用HPLC法测定，以峰面积-丙烯酰胺质量浓度绘制标准曲线。

1.3.3熏醅褐色度测定

以1.3.2方法制得熏醅水提液，使用紫外-可见分光光度计在波长420 nm处测定各熏醅水提液吸光度值，得到熏醅样品褐色度以AU值表示。

1.3.3相关性分析

用SPSS 17.0数据分析软件对熏醅提取液的川芎嗪、丙烯酰胺与褐色度进行相关性分析，在0.01水平上进行显著性检验。

2　结果与分析

2.1老陈醋熏醅中川芎嗪与丙烯酰胺的高效液相色谱测定

图1　川芎嗪标准品（A）及样品（B）的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of ligustrazine standard（A）and sample（B）

由图1可知，川芎嗪标准品在1.3.1色谱条件下测定，峰型较好，保留时间为15.33 min（见图1A）；老陈醋熏醅样品按照本实验方法（1.3.1）进行提取及色谱测定，川芎嗪的分离度良好，保留时间为15.33 min（见图1B），日内和日间精密度分别是2.03%和4.25%，表明仪器和方法的精密度都较好，样品加标回收率范围为96.95%～103.72%，表明方法的重现性良好。说明本研究采用的熏醅样品提取处理及HPLC测定川芎嗪的方法较为合理。

图2　丙烯酰胺标准品（A）及样品（B）的HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of acrylamide standard（A）and sample（B）

采用HPLC法对丙烯酰胺测定结果如图2所示。由图2可知，丙烯酰胺标准品在1.3.2色谱条件下测定，峰型良好，保留时间为10.13 min（见图2A）；熏醅样品水提液在相同色谱条件下测定，杂峰较少，丙烯酰胺分离度较好（见图2B），日内和日间精密度分别为2.41%和4.85%，表明仪器和方法的精密度均较好，样品加标回收率范围为95.19%～105.85%，表明测定方法的重现性良好。说明本实验采用的样品提取处理及HPLC测定丙烯酰胺的方法较为合理。

2.2不同熏醅工艺条件对老陈醋褐色度、川芎嗪和丙烯酰胺含量的影响

褐色度能间接反映老陈醋熏醅中美拉德反应的程度及类黑精的生成量［11-12］，据研究［13-14］报道，温度每提高10℃可使美拉德反应的速率提高3～5倍。不同熏醅工艺条件下老陈醋褐色度、川芎嗪和丙烯酰胺的测定结果见表1。由表1可知，无论炭火熏醅还是蒸汽熏醅，延长熏醅时间（1～5 d）或提高熏醅温度（90～120℃），老陈醋褐色度均随之逐渐增大（0.12～0.41 AU，0.16～1.08 AU），表明提高熏醅温度或延长时间加剧了其美拉德反应的程度，同时蒸汽熏醅比炭火熏醅加快了美拉德反应的速率，如在熏醅温度（90℃）和时间相同（1～3 d）的条件下，蒸汽熏醅褐色度（0.16～0.54 AU）比炭火熏醅（0.12～0.13 AU）提高了33.33%～315.38%。

表1　不同熏醅工艺条件下老陈醋褐色度、川芎嗪和丙烯酰胺含量的测定结果Table 1 Determination results of brown degree，ligustrazine and acrylamide content of Shanxi aged vinegar with different fumigation conditions

XU Y等［15-16］的研究认为，热加工食品中的川芎嗪及丙烯酰胺均主要来源于美拉德反应。本研究采用SPSS 17.0数据分析软件对不同熏醅工艺及条件的熏醅褐色度、川芎嗪和丙烯酰胺含量（表1）进行了相关性检验，结果显示，川芎嗪、和丙烯酰胺含量与褐色度呈正相关（相关系数分别为0.876和0.885，P＜0.01），此结果证实了在老陈醋熏醅过程中生成的川芎嗪与丙烯酰胺均是美拉德反应产物。表1测定结果显示，在蒸汽熏醅24 h时，随着熏醅温度的提高（90℃、100℃、120℃），川芎嗪含量随之增加为45.14 μg/g醅、79.02 μg/g醅和148.05 μg/g醅，丙烯酰胺含量为0、0.47 μg/g醅、1.54 μg/g醅；在蒸汽熏醅120℃时，随着熏醅时间的延长（6 h、12 h、24 h），川芎嗪含量随之增加为98.66 μg/g醅、106.22 μg/g醅、148.05 μg/g醅，丙烯酰胺含量随之增加为0.70 μg/g醅、0.75 μg/g醅和1.54 μg/g醅。表明老陈醋的川芎嗪与丙烯酰胺生成量随着熏醅中美拉德反应程度的加剧而逐渐增加。相关性检验结果表明，在老陈醋熏醅过程中，川芎嗪与丙烯酰胺这二者的生成量呈正相关（相关系数为0.982，P＜0.01），只是丙烯酰胺比川芎嗪需要更高的美拉德反应温度才会生成。如表1结果显示，无论炭火熏醅还是蒸汽熏醅，在熏醅温度90℃，熏至5 d的醋醅中仍未检出丙烯酰胺，而在100℃以上熏醅中丙烯酰胺才有生成，这与加拿大卫生部［17-18］的报道相一致，其研究是将还原糖和天冬酰胺加热至100℃以上时发现有丙烯酰胺生成。另外，在低温90℃分别熏醅1 d、2 d和3 d，蒸汽熏醅的川芎嗪含量（45.14 μg/g醅、57.58 μg/g醅、70.74 μg/g醅）均显著高于炭火熏醅的川芎嗪含量（37.54 μg/g醅、39.40 μg/g醅、41.20 μg/g醅），其原因可能与炭火熏醅工艺每日翻醅会造成醅料内部的温度不稳定，并且导致川芎嗪等成分的挥发逸散等因素有关。研究结果表明，传统的低温熏醅（90℃）有利于避免丙烯酰胺这一有害物质的生成，在低温熏醅的前提下，蒸汽熏醅比炭火熏醅既避免了丙烯酰胺的生成，又显著提高了川芎嗪的生成量，所以，低温蒸汽熏醅工艺更值得提倡推广。

3　结论

（1）在相同的熏醅工艺条件（90℃，1～3 d）下，蒸汽熏醅褐色度（0.16～0.54 AU）比炭火熏醅（0.12～0.41 AU）提高了33%～315%，表明蒸汽熏醅方式比炭火熏醅能加快美拉德反应的速率。

（2）老陈醋熏醅过程中生成的川芎嗪和丙烯酰胺与褐色度呈正相关（相关系数分别为0.876和0.885，P＜0.01），表明它们均是美拉德反应产物。

（3）在蒸汽熏醅24 h时，随着熏醅温度的提高（90～120℃），川芎嗪含量随之增加为45.14～148.05 μg/g醅，丙烯酰胺含量为0～1.54 μg/g醅；在蒸汽熏醅120℃时，随着熏醅时间的延长（6～24h），川芎嗪含量随之增加为98.66～148.05 μg/g醅，丙烯酰胺含量随之增加为0.70～1.54 μg/g醅，表明川芎嗪与丙烯酰胺的生成量随着熏醅温度的升高和时间的延长而逐渐增加，并且二者呈现正相关（相关系数为0.982，P＜0.01），只是，丙烯酰胺比川芎嗪需要更高的熏醅温度（100℃以上）才会生成。

（4）无论是炭火熏醅方式还是蒸汽熏醅，90℃熏醅至5 d时仍未检出丙烯酰胺，表明低温熏醅有利于避免丙烯酰胺这一有害物质的生成。90℃熏醅1～3 d，蒸汽熏醅的川芎嗪含量（45.14～70.74 μg/g醅）显著高于炭火熏醅的川芎嗪含量（37.54～41.20 μg/g醅），表明在低温（90℃以下）熏醅的前提下，既能避免丙烯酰胺的生成，又能显著提高川芎嗪的生成量，低温蒸汽熏醅工艺更值得提倡推广。

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Effect of different fumigation process conditions on ligustrazine and acrylamide content of Shanxi aged vinegar

LI Hongwen，LI Xiaohui，ZHAO Wenliang，YANG Xiaolan*
（College of Life Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

The effect of different fumigation processing（steam fumigation and charcoal fumigation）and the processing conditions（temperature and time）on ligustrazine and acrylamide content was studied.The results showed that the steam fumigation can accelerate Maillard reaction rate than charcoal fumigation，the ligustrazine and acrylamide content increased with temperature rising and time prolonging during fumigation，acrylamide generation required higher fumigating temperature（above 100℃）than ligustrazine.Whether steam fumigation or charcoal fumigation，acrylamide was not detected at 90℃fumigating to 5 d，which indicated that low temperature fumigation（below 90℃）was helpful to avoid acrylamide production.On the premise of low temperature fumigation，compared with charcoal fumigation，steam fumigation not only avoided acrylamide generation，but also facilitated the formation of ligustrazine and brown degree.The steam fumigation technology has a great potential for popularization and application.

steam fumigation；charcoal fumigation；ligustrazine；acrylamide；HPLC

TS264.2

0254-5071（2016）07-0036-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.008

2016-03-10

国家自然科学基金面上项目（31171748）；山西省科技攻关项目（20140321020-01，20110321078）

李弘文（1989-），女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术与功能食品。

杨小兰（1956-），女，教授，本科，研究方向为食品生物技术。