响应面法优化可食性鸡蛋清蛋白膜的磷酸化改性工艺

郑 优，贾 亮，段 蓉，马莹莹（西南大学荣昌校区，重庆402460）

响应面法优化可食性鸡蛋清蛋白膜的磷酸化改性工艺

郑 优，贾 亮，段 蓉，马莹莹
（西南大学荣昌校区，重庆402460）

以鸡蛋清粉为成膜原料，制备可食性膜，研究磷酸化改性工艺对膜性能的影响。以三聚磷酸钠添加量、反应时间、反应温度及反应pH为因素，以断裂伸长率、拉伸强度、透油系数及水蒸气透过系数为响应值，采用响应面分析法，优化膜的磷酸化改性工艺。结果表明，以三聚磷酸钠添加量21.24 g/100 g蛋白、反应2 h、反应温度45℃、pH9.6的最佳工艺制备所得膜各性能指标的预测值分别是：断裂伸长率77.124%、拉伸强度4.911 MPa、透油系数0.868 g·mm/（m2·d）、水蒸气透过系数3.458 g·mm/（m2·d·kPa），对应的验证值分别为：75.394%±5.276%、（4.887±0.119）MPa、（0.882± 0.009）g·mm/（m2·d）、（3.501±0.088）g·mm/（m2·d·kPa），所得的回归模型拟合度良好，并具有较好的预测性。

鸡蛋清蛋白，磷酸化，可食性膜

可食性膜（edible films）是指以天然可食性物质（如多糖［1］、蛋白质［2］、脂类等）为基材，添加交联剂、增塑剂［3］等成膜助剂，通过不同分子间的互相作用形成的薄膜。鸡蛋清粉是一种来源广泛、营养价值高的食品加工原料，含有人体所需的8种必需氨基酸［4］。国内外科技工作者已对鸡蛋清蛋白的部分功能特性作了相关基础研究［5-7］，但对以鸡蛋清蛋白为成膜基材的可食性膜性能的研究很少。

蛋白质基膜具有很强的亲水性，抗水能力差，在高湿条件下的应用受到限制。近年来，国内外研究人员已研究了各种改性手段（如化学改性［8］、物理改性［9-10］等）对可食性蛋白膜性能的改善效果，但对可食膜化学改性的研究主要集中在谷氨酰胺转氨酶改性［11-12］，关于磷酸化改性的研究鲜见报道。另外，磷酸化改性处理大多集中在对蛋白质的溶解性能［13］、凝胶性能［14］及起泡性能［15］等的研究，对蛋白质成膜性的研究鲜见报道。本文以鸡蛋清粉为基材，制备可食性鸡蛋清蛋白膜，并以三聚磷酸钠添加量、反应时间、反应温度及反应pH为实验因素，采用响应面分析法优化磷酸化改性工艺，探讨实验因素对膜性能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鸡蛋清粉（BR级，蛋白质含量80%） 成都西亚化工股份有限公司；三聚磷酸钠、甘油、聚乙二醇400均为分析纯 重庆市迎龙化工有限公司。

手持式测厚仪 济南兰光机电技术有限公司；90-2型定时恒温磁力搅拌器 上海沪西分析仪器厂；JH-721型可见分光光度计 上海现科仪器有限公司；透析袋（14000） 上海源叶生物科技有限公司；XYW（L）-PC智能电子拉力测试机 济南兰光机电发展有限公司；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；PB-10 sartorius精密pH计 德国赛多利斯公司；

1.2 实验方法

1.2.1 鸡蛋清粉磷酸化反应工艺流程 称取8 g鸡蛋清粉→溶解→分批加入一定量的三聚磷酸钠，维持一定pH→磁力搅拌一定时间→置于透析袋中透析（4℃，24 h）→透析液备用。

1.2.2 可食性鸡蛋清蛋白膜的制备工艺流程 膜液配方：磷酸化鸡蛋清蛋白8 g/100 mL，增塑剂甘油/聚乙二醇400（3/1）3 g/100 mL，交联剂环氧氯丙烷0.71 g/100 mL，增强剂CMC-Na 0.55 g/100 mL。

透析液→加成膜助剂（增塑剂、交联剂和增强剂）→磁力搅拌（30 min）→水浴加热搅拌→过滤→脱气→成膜→干燥→揭膜→贮存→待测。

1.2.3 指标测定

1.2.3.1 膜厚（FT）测定 用手持式测厚仪在膜上随机取3点测定，结果以平均值±标准差表示，单位为mm。

1.2.3.2 磷酸化程度测定 按照GB/T 12393-1990的钼兰比色法［16］测定磷酸化改性后鸡蛋清蛋白含磷量，以未改性的鸡蛋清蛋白含磷量作空白，磷酸化程度用每克鸡蛋清蛋白含磷的毫克数表示。

1.2.3.3 拉伸强度（TS）与断裂伸长率（E）测定 参照GB/T 13022-91的规定，用智能电子拉力测试机测定。断裂伸长率（E）和拉伸强度（TS）分别按下式计算［17］：

式中，E为断裂伸长率（%）；L0为试样原始标线距离（mm）；L为试样断裂时标线间距离（mm）。

式中，TS为拉伸强度（MPa）；p为试样断裂时的最大负荷（N）；b为试样宽度（mm）；d为试样厚度（mm）。

1.2.3.4 透油系数（PO）测定［18］在试管中加5 mL色拉油，用待测膜封口，倒置在滤纸上，在密封环境中放置2 d，称量滤纸的质量变化，按下式计算：

式中：PO为透油系数（g·mm/（m2·d））；ΔW为时间T内滤纸质量的变化（g）；FT为膜厚（mm）；S为膜面积（m2）；T为测试时间（d），本实验为2 d。

1.2.3.5 水蒸气透过系数（WVP）测定 参照GB1037-88的规定，采用拟杯子法测定。按下式计算［19］：

式中，WVP为水蒸气透过系数（g·mm/（m2·d·kPa））；ΔW为时间T内水蒸气透过量（g）；FT为膜厚（mm）；S为膜面积（m2）；T为测试时间（d），本实验为2 d；ΔPV为膜两侧水蒸气压差（kPa）。

1.2.4 单因素实验 选取三聚磷酸钠添加量、反应时间、反应温度及反应pH为实验因素，研究这4个因素对断裂伸长率、拉伸强度、透油系数、水蒸气透过系数、磷酸化程度的影响，结果以平均值±标准差表示。

1.2.4.1 三聚磷酸钠添加量的单因素实验设计 固定反应pH为9.0，反应温度为室温，反应时间为1 h，研究不同三聚磷酸钠添加量（0、10、15、20、25、30 g/100 g蛋白）对膜性能的影响；

1.2.4.2 反应时间的单因素实验设计 固定三聚磷酸钠添加量为20 g/100 g蛋白，反应pH为9.0，反应温度为45℃，研究不同反应时间（0.5、1、1.5、2、2.5 h）对膜性能的影响。

1.2.4.3 反应温度的单因素实验设计 固定三聚磷酸钠添加量为20 g/100 g蛋白，反应pH为9.0，反应时间为1 h，研究不同反应温度（20、25、35、45、55、65℃）对膜性能的影响。

1.2.4.4 反应pH的单因素实验设计 固定三聚磷酸钠添加量为20 g/100 g蛋白，反应温度为室温，反应时间为1 h，研究不同反应pH（7、8、9、10、11）对膜性能的影响。

1.2.5 响应面实验设计 在单因素实验的基础上，利用Design-Expert软件，以三聚磷酸钠添加量、反应时间、反应温度及反应pH为自变量，以断裂伸长率（Y1）、拉伸强度（Y2）、透油系数（Y3）和水蒸气透过系数（Y4）为响应值，优化可食性鸡蛋清蛋白膜的磷酸化改性工艺。因素水平表见表1。

表1 响应面实验因素水平表Table1 Factors and levels of response surface design

1.2.6 数据统计与分析 利用Design-Expert软件对响应面实验结果进行方差分析（p＜0.05），每个实验处理均作3个平行，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 三聚磷酸钠添加量对可食性鸡蛋清蛋白膜性能的影响 由图1可看出，膜的拉伸强度在0～20 g/ 100 g蛋白的范围内不断增大并达到最大值4.750 MPa，在20～30 g/100 g蛋白的范围内有所下降。膜的断裂伸长率随着三聚磷酸钠添加量的增大呈上升趋势，并于25 g/100 g蛋白处达峰值73.400%。由图2可看出，膜的水蒸气透过系数和透油系数在0～20 g/100 g蛋白的范围内不断下降并分别达最小值3.750 g·mm/ （m2·d·kPa）和0.939 g·mm/（m2·d）。由图3可看出，随着三聚磷酸钠添加量的增加，鸡蛋清蛋白的磷酸化程度先上升后下降，在添加量为20 g/100 g蛋白处达峰值。因此确定最佳的添加量为20 g/100 g蛋白，此时磷酸化程度为32.59 mg/g。

图1 三聚磷酸钠添加量对膜机械性能的影响Fig.1 Effect of STP dosage on mechanical properties of film

图2 三聚磷酸钠添加量对膜阻隔性能的影响Fig.2 Effect of STP dosage on barrier properties of film

图3 三聚磷酸钠添加量对鸡蛋清蛋白磷酸化程度的影响Fig.3 Effect of STP dosage on phosphorylation degree of albumin

2.1.2 反应时间对可食性鸡蛋清蛋白膜性能的影响由图4和图5可看出，随着反应时间的延长，膜的拉伸强度逐渐增大并在2 h处达最大值4.820 MPa，超过2 h后，拉伸强度略有降低。膜的断裂伸长率在0.5～1.5 h的范围内不断上升并达到峰值73.700%，在1.5～2.5 h的范围内有所下降。膜的水蒸气透过系数和透油系数随着反应时间的增加不断降低并在2 h处分别达最小值3.630 g·mm/（m2·d·kPa）和0.908 g·mm/（m2·d）。而由图6可知，随着反应时间的延长，鸡蛋清蛋白的磷酸化程度不断增加，但在2 h后趋于稳定。确定最佳的反应时间为2 h，此时磷酸化程度为36.78 mg/g。

2.1.3 反应温度对可食性鸡蛋清蛋白膜性能的影响

图4 反应时间对膜机械性能的影响Fig.4 Effect of reaction time on mechanical properties of film

图5 反应时间对膜阻隔性能的影响Fig.5 Effect of reaction time on barrier properties of film

图6 反应时间对鸡蛋清蛋白磷酸化程度的影响Fig.6 Effect of reaction time on phosphorylation degree of albumin

由图7可看出，膜的拉伸强度和断裂伸长率均随着反应温度的升高呈先上升后下降的趋势，并在45℃时分别达峰值4.890 MPa和75.300%。由图8可知，膜的水蒸气透过系数和透油系数均呈先下降后上升的趋势，并在反应温度为45℃时达最小值3.540 g·mm/ （m2·d·kPa）和0.885 g·mm/（m2·d）。由图9可知，鸡蛋清蛋白磷酸化程度随反应温度的升高先增大后减小，并在45℃达最大值。因此最适的反应温度为45℃，此时磷酸化程度为39.13 mg/g。

2.1.4 反应pH对可食性鸡蛋清蛋白膜性能的影响

由图10可看出，在pH为7～9时，膜的拉伸强度和断裂伸长率均不断增大，并达较大值4.880 MPa和75.200%，在pH为10时的数据与之无显著性差异，大于10之后，膜的拉伸强度和断裂伸长率略有下降。由图11可知，在pH为7～9时，膜的水蒸气透过系数和透油系数均逐渐降低，并在pH为9时分别达最小值3.540 g·mm/ （m2·d·kPa）和0.889 g·mm/（m2·d），但与pH为10时的数值3.510 g·mm/（m2·d·kPa）和0.879 g·mm/（m2·d）差异不显著。由图12可知，鸡蛋清蛋白磷酸化程度随反应pH呈不断上升趋势，但在pH为9时上升趋势放缓。综合考虑膜的性能，确定最佳反应pH为9～10，此时的磷酸化程度约为38.81 mg/g。

图7 反应温度对膜机械性能的影响Fig.7 Effect of reaction temperature on mechanical properties of film

图8 反应温度对膜阻隔性能的影响Fig.8 Effect of reaction temperature on barrier properties of film

图9 反应温度对鸡蛋清蛋白磷酸化程度的影响Fig.9 Effect of reaction temperature on phosphorylation degree of albumin

图10 反应pH对膜机械性能的影响Fig.1 0 Effect of pH value on mechanical properties of film

图11 反应pH对膜阻隔性能的影响Fig.1 1 Effect of pH value on barrier properties of film

图12 反应pH对鸡蛋清蛋白磷酸化程度的影响Fig.1 2 Effect of pH value on phosphorylation degree of albumin

2.2 响应面实验结果及分析

2.2.1 响应面实验设计及结果 实验结果见表2。

2.2.2 回归模型建立及显著性检验 利用Design-Expert软件对表2中的实验数据进行回归拟合，获得膜4个性能指标的回归方程如下：

由表3可以看出，四个响应值的模型回归均极显著（p＜0.001），且失拟项在不显著（p＞0.05），这表明四个模型的拟合度均较好。同时，这四个模型均具有较低的离散系数（CV=1.01%、1.09%、1.16%、1.19%），说明整个实验具有较好的精确度和可靠性。

2.2.3 响应面分析 膜各性能指标的回归方程系数及显著性分析见表4。

由表4可看出，X1和X4是影响Y1的主要因素，X1X4、X2X4的交互作用显著，响应面见图13、图14。以图13为例，当反应pH一定时，膜断裂伸长率随三聚磷酸钠添加量的增大不断上升，表现为响应面曲线较陡；当固定三聚磷酸钠添加量时，膜断裂伸长率随反应pH的增大变化较平缓。从图13可看出响应面存在极大值。

表2 响应面实验方案及结果Table2 Scheme and experimental results for response surface design

表3 断裂伸长率、拉伸强度、透油系数和水蒸气透过系数的回归模型方差分析Table3 Analysis of variance for the fitted quadratic model of elongation，tensile strength，PO and WVP

续表

表4 各性能指标的回归方程系数及显著性分析Table4 Analysis of significance test of the regression coefficients of film properties

从表4可以看出，X1和X4对Y2影响显著，X1X3、X1X4的交互作用显著，见图15～图16。以图16为例，当反应pH一定时，膜拉伸强度随三聚磷酸钠添加量的增加先上升后下降；当固定三聚磷酸钠添加量时，膜拉伸强度随反应pH的增大不断增大。响应面在反应pH在8.5～9.5范围，三聚磷酸钠添加量为17～21 g/100 g蛋白范围时存在极值。

从表4可看出，X1和X4对Y3、Y4影响显著。交互项X14、X34对Y3的影响显著，交互项X14和X24对Y4的影响显著，它们的响应面见图17～图20。由这些响应面图可知，反应时间和反应温度对透油系数和水蒸气透过系数的影响不大，而三聚磷酸钠添加量和反应pH对响应值的影响较大，4个响应面均存在极小值。

图13 反应pH、三聚磷酸添加量对膜断裂伸长率的影响Fig.1 3 Effect of pH and STP dosage on E

图14 反应pH、反应时间对膜断裂伸长率的影响Fig.1 4 Effect of pH and reaction time on E

2.2.4 磷酸化改性工艺的优化与验证 采用Design-Expert软件，对4个回归方程进行联合求解，得可食性鸡蛋清蛋白膜断裂伸长率、拉伸强度的最大值分别为77.124%、4.911 MPa，透油系数的最小值为0.868 g·mm/（m2·d），水蒸气透过系数的最小值为3.458 g·mm/（m2·d·kPa）。此时的磷酸化改性工艺为：三聚磷酸钠添加量21.24 g/100 g蛋白、反应时间2 h、反应温度45℃、反应pH9.6。为了验证回归方程的有效性和准确性，在最佳磷酸化改性工艺下制备可食性鸡蛋清蛋白膜并进行指标测定，得出各性能指标分别为：断裂伸长率75.394%±5.276%、拉伸强度（4.887±0.119）MPa、透油系数为（0.882±0.009）g·mm/（m2·d），水蒸气透过系数（3.501±0.088）g·mm/（m2·d·kPa），与预测值接近，可见上述回归模型能较好地预测膜的性能随各因素的变化情况，优化结果可靠。

图15 反应温度、三聚磷酸添加量对膜拉伸强度的影响Fig.1 5 Effect of reaction temperature and STP dosage on TS

图16 反应pH、三聚磷酸添加量对膜拉伸强度的影响Fig.1 6 Effect of pH and STP dosage on TS

图17 三聚磷酸添加量、反应pH对透油系数的影响Fig.1 7 Effect of STP dosage and pH on PO

图18 反应温度、反应pH值对透油系数的影响Fig.1 8 Effect of reaction temperature and pH on PO

图19 反应pH、三聚磷酸添加量对水蒸气透过系数的影响Fig.1 9 Effect of pH and STP dosage on WVP

图20 反应pH、反应时间对水蒸气透过系数的影响Fig.2 0 Effect of pH and reaction time on WVP

3 结论

磷酸化改性工艺对可食性鸡蛋清蛋白膜的性能有较大影响。反应pH和三聚磷酸钠添加量是影响可食性膜性能的主要因素。通过响应面分析法建立了数学模型，并对其磷酸化改性工艺进行了优化，得到的最优工艺为：三聚磷酸钠添加量21.24 g/100 g蛋白、反应时间2 h、反应温度45℃、反应pH9.6，在此条件下断裂伸长率为75.394%±5.276%、拉伸强度可达（4.887± 0.119）MPa、透油系数为（0.882±0.009）g·mm/（m2·d），水蒸气透过系数可达（3.501±0.088）g·mm/（m2·d·kPa），所得回归模型的拟合度较好，具有良好的预测性，优化结果可靠。

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Optimization of phosphorylation modification conditions of albumin edible film by response surface methodology

ZHENG You，JIA Liang，DUAN Rong，MA Ying-ying
（Rongchang Campus，Southwest University，Chongqing 402460，China）

With the egg albumin as raw material，edible films were achieved.Effects of phosphorylation modification on properties of edible films were studied.With sodium triphosphate addition，reaction time，reaction temperature and pH value，being response factors and elongation，tensile strength，oil permeability，water vapor permeability being response values，the phosphorylation modification conditions of edible film was optimized through response surface methodology.The results showed that the optimal phosphorylation modification conditions were sodium triphosphate addition 21.24 g/100 g protein，reaction time 2 h，reaction temperature 45℃and pH value 9.6.Under this condition，the properties of edible films were（75.394±5.276）%，（4.887±0.119）MPa，（0.882±0.009）g·mm/（m2·d），（3.501±0.088）g·mm/（m2·d·kPa），approaching to the predicted values，77.124%，4.911 MPa，0.868 g·mm/（m2·d），3.458 g·mm/（m2·d·kPa），so the optimal results were reliable.

egg albumin；phosphorylation；edible film

TS206.4

B

1002-0306（2016）06-0242-08

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.042

2015－07－17

郑优（1989-），女，硕士研究生，实验师，研究方向：畜产品加工及贮藏，E-mail：zhengyou1989@163.com。

中央高校基本业务费专项资金资助（XDJK2016C054）；西南大学荣昌校区科研启动基金（20700209）；西南大学荣昌校区青年基金项目（20700438）。