HPLC法测定野蔷薇中齐墩果酸和熊果酸的含量

古力齐曼·阿布力孜，阿吾提·艾买尔，毛居代·亚尔买买提，迪丽努尔·马里克，*（.新疆师范大学化学化工学院，新疆乌鲁木齐830054；.新疆师范大学生命科学学院，新疆乌鲁木齐830054）

HPLC法测定野蔷薇中齐墩果酸和熊果酸的含量

古力齐曼·阿布力孜1，阿吾提·艾买尔1，毛居代·亚尔买买提2，迪丽努尔·马里克1，*
（1.新疆师范大学化学化工学院，新疆乌鲁木齐830054；2.新疆师范大学生命科学学院，新疆乌鲁木齐830054）

目的：采用HPLC法测定野蔷薇不同部位（根、茎、果实）中齐墩果酸和熊果酸的含量，比较不同产地野蔷薇果实中齐墩果酸和熊果酸含量的差异。方法：采用Zorbax ODS色谱柱（4.6 mm×250 mm×5 μm），以甲醇-水（88∶12）为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长为210 nm。结果：齐墩果酸和熊果酸在20 min内较好分离，其质量浓度分别为0.02468～0.2468 mg/mL和0.02523～0.2523 mg/mL时与峰面积线性关系良好，相关系数分别为0.9994和0.9996；平均回收率为分别为99.96%（RSD为0.74%）和100.03%（RSD为0.95%）。结论：该方法操作简便、结果准确、重现性好，可同时测定野蔷薇中齐墩果酸和熊果酸的含量，均在果实中含量最高；库车县、阿图什市的野蔷薇果实中齐墩果酸和熊果酸的含量最多，可作为最适开发利用的固定来源。

野蔷薇，齐墩果酸，熊果酸，HPLC色谱法，含量测定

野蔷薇（Rosa Multiflora Thunb.）属于蔷薇科蔷薇属植物，又名多花蔷薇，是一种重要的药食两用的植物资源［1］。野蔷薇药用作用广泛，根、茎、叶、花、果均可入药，具有祛风除湿、清热解毒、活血、调经、固精缩尿之功效等［2］。现代药理研究表明，齐墩果酸有消炎抑菌、降转氨酶、防止肝硬化、降血脂、降血糖等多方面的临床药理作用，是治疗肝炎的有效药物之一［3-9］；熊果酸具有免疫调节作用及较好的抗肿瘤活性，对肿瘤形成各阶段都有预防和抑制作用。新疆野蔷薇不仅资源储量大，而且野蔷薇种源极为丰富。中药中齐墩果酸和熊果酸常并存，两者互为同分异构体，不易分离，因此流动相的选择应是两成分达到基线分离。

近年来，已有文献报道用高效液相色谱测定红枣、芍药、石见穿、白花蛇舌草、枇杷叶、夏枯草、柿叶、山楂中齐墩果酸（OA）和熊果酸（UA）的含量［10-17］，但目前未见有关野蔷薇中齐墩果酸和熊果酸含量测定的相关报道。因此，为了研究野蔷薇中齐墩果酸和熊果酸的含量差异，本实验采用高效液相色谱法建立了野蔷薇不同部位（根、茎、果实）中齐墩果酸和熊果酸含量测定的方法，并对来自新疆12批不同产地野蔷薇果实中齐墩果酸和熊果酸进行了含量测定，为不同产地野蔷薇药材提供质量控制依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

齐墩果酸标准品、熊果酸标准品 中国药品生物制品检定所，纯度99.9%，批号：110709-200505、110742-200519；甲醇 色谱纯，美国MREDA公司；三乙胺 色谱纯，美国MREDA公司；冰乙酸 分析纯，天津市致远化学试剂有限公司；野蔷薇根、茎、果实 由新疆大学资源与环境科学学院努尔拜·阿布都沙勒克教授鉴定为蔷薇科蔷薇属植物野蔷薇（Rosa Multiflora Thunb.）的干燥根、茎、果实，果实产地分别为乌鲁木齐南山、阿勒泰市、塔城市、博乐市、库尔勒市、拜城县、新和县、库车县、温宿县、阿瓦提县、喀什市、阿图什市。

高效液相色谱仪 安捷伦1200LC，美国；色谱柱 安捷伦公司，Zorbax ODS4.6 mm×250 mm×5 μm；KQ2200DE超声波清洗器 昆仑市超声仪器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵 巩义市英峪予华仪器厂生产；RE-52AA型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂生产；MX5型分析天平 Mettler Toledo-瑞士。

1.2 实验方法

1.2.1 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的齐墩果酸对照品2.468 mg，熊果酸对照品2.523 mg，置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，得含齐墩果酸质量浓度为0.2468 mg/mL，熊果酸的质量浓度为0.2523 mg/mL的混合对照品溶液，置4℃冰箱中保存，待用。

1.2.2 供试品溶液的制备 取一定量野蔷薇根、茎和果实粉碎，过16目筛，石油醚脱脂，干燥，精密称取野蔷薇粉末各取3.0 g，分别置于100 mL锥形瓶中加入50 mL甲醇，称重，浸泡3 h，超声提取（频率40 kHz，45 min，35℃），放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，抽滤，滤液浓缩至5 mL，用0.45 μm微孔滤膜过滤，HPLC测定含量。

1.2.3 色谱条件 采用Agilent Zorbax ODS（4.6 mm×250 mm×5 μm）色谱柱，流动相A为甲醇，流动相B为缓冲溶液：三乙胺用冰乙酸调pH至5～7；甲醇-水（88∶12）；流速1.0 mL/min；检测波长为210 nm；柱温25℃；进样量为30 μL。

2 结果与讨论

2.1 齐墩果酸和熊果酸的测定

对于分析时间、分离度、峰形等液相色谱分离分析的主要影响因素进行了探讨并确定的最佳色谱条件为甲醇-水（88∶12）为流动相，柱温为25℃，检测波长为210 nm，流速为1.0 mL/min。此条件下得到同时分析齐墩果酸和熊果酸清晰图谱，齐墩果酸的保留时间16.476 min，熊果酸的保留时间17.521 min，一次进样全部色谱峰在20 min内完成，分析时间较短，色谱波动较小，齐墩果酸和熊果酸色谱峰分离度达到1.446，拖尾因子0.983、1.005。

图1 混合对照品和野蔷薇提取液色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of mixed oleanolic acid and ursolic acid standards and extract from Rosa multiflora thunb

2.2 方法学评价

2.2.1 标准曲线和线性关系 分别精密吸取混合对照溶液50、100、200、300、400、500 μL用甲醇定容至500 μL，摇匀，按1.2.3节色谱条件进行测定。结果表明，齐墩果酸质量浓度在0.02468～0.2468 mg/mL内线性关系良好，齐墩果酸的线性方程为：Y=10924.0173C-42.0068（r=0.9994）；熊果酸的质量浓度在0.02523～0.2523 mg/mL内线性关系良好，熊果酸线性方程为：Y=9873.65167C-34.108（r=0.9996）。该方法对齐墩果酸和熊果酸的最低检出限（按信噪比为3计）分别为3 ng和12 ng。

2.2.2 精密度实验 精密吸取齐墩果酸和熊果酸混合对照品溶液，连续进样5次，每次30 μL，测定峰面积。结果表明相对标准偏差（RSD）为2.19%和1.35%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 重现性实验 准确称取同一批野蔷薇根（乌鲁木齐市南山）样品5份，按1.2.2节的方法制备样品溶液，准确吸取30 μL进样分析，进行含量测定。计算齐墩果酸平均含量的RSD为1.51%，熊果酸平均含量的RSD为1.03%。

2.2.4 加标回收实验 称取6份野蔷薇根（乌鲁木齐市南山）样品1.0 g，分低、中、高浓度三组，分别加入混合对照品溶液适量（1.0、1.5、2.0 mL），按1.2.2节的方法配制加标样品溶液，测定齐墩果酸和熊果酸的含量，计算加标回收率。该方法齐墩果酸和熊果酸平均回收率分别为99.96%、100.03%，回收率的相对标准偏差（RSD）分别为0.74%、0.95%。结果见表1。

2.2.5 样品的稳定性实验 按1.2.2节样品处理的方法制备样品（乌鲁木齐市南山）溶液，放置4℃冰箱里，以第一天的测定值为基准，分别在1、3、5、7、9 d进样30 μL，测定其含量，计算齐墩果酸和熊果酸稳定性RSD分别为0.47%和0.18%（n=5），相对标准偏差（RSD）均较小，表明处理后的样品溶液至少在9 d内4℃冰箱里可稳定保存。

表1 齐墩果酸和熊果酸回收率分析（n=6）Table1 Mean spike recoveries for oleanolic acid and ursolic acid in a blank sample（n=6）

2.2.6 样品的测定 精密吸取根、茎和果实（乌鲁木齐市南山）的供试品溶液各30 μL，测定齐墩果酸和熊果酸的峰面积，计算齐墩果酸和熊果酸的平均含量，结果见表2。

表2 野蔷薇不同部位中齐墩果酸和熊果酸的含量测定结果（n=5）Table2 Determination of oleanolic acid and ursolic acid in the different parts of Rosa multiflora Thunb.（n=5）

表3 12批产地野蔷薇果实中齐墩果酸和熊果酸的测定结果（n=5）Table3 Determination of oleanolic acid and ursolic acidcontents in Rosa multiflora Thunb.fruits from 12 regions（n=5）

由表2可知，野蔷薇根、茎和果实均含有齐墩果酸和熊果酸，根和茎中齐墩果酸和熊果酸含量差异不大，但果实中两者含量相差二倍多，且总含量最多，由此可知果实是野蔷薇最适进一步开发利用的部位。因此，取12批新疆不同产地野蔷薇果实样本，制备供试品溶液1.2.3节色谱条件进行测定，计算熊果酸、齐墩果酸的含量，结果见表3。

由表3可知，不同产地野蔷薇果实中齐墩果酸和熊果酸的含量范围分别为0.2724～0.8674 mg/g和0.1602～0.6409 mg/g，含量差异较大。库车县和阿图什市野蔷薇果实中齐墩果酸和熊果酸的总含量最高。

3 结论

采用高效液相色谱法同时测定野蔷薇中齐墩果酸和熊果酸的含量。实验结果表明，野蔷薇不同部位均含齐墩果酸和熊果酸，果实中齐墩果酸和熊果酸的总含量高于野蔷薇茎和根；不同产地野蔷薇果实中库车县和阿图什市野蔷薇果实中齐墩果酸和熊果酸的总含量最高。本文建立的高效液相色谱法样品处理快捷、简便、重现性好，可同时测定齐墩果酸和熊果酸的含量，两者达到基线分离。该方法更全面的反映中药的物质信息，为野蔷薇的用药和食品加工提供了一定的实验依据。

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Determination of oleanolic acid and ursolic acid in Rosa Multiflora Thunb.by HPLC

Gulqiman·ABLIZ1，Awut·AMAR1，Maojudai·YAERMAIMAITI2，Dilnur·MALIK1，*
（1.Chemistry and Chemical Engineering，Xinjiang Normal University，Urumqi 830054，China；2.College of Life Science Xinjiang Normal University，Urumqi 830054，China）

Objective：The content of oleanolic acid（OA）and ursolic acid（UA）in different arts（roots，stems，fruits）of Rosa Multiflora Thunb.have been compared，and taken analysis on content of OA and UA in Rosa Multiflora Thunb.fruit from different origin by HPLC.Methods：Zorbax ODS chromatography column（4.6 mm×250 mm×5 μm），methanol-water（88∶12）was used as mobile phase，diode array detector at 210 nm wavelength had been used for detection.Results：The OA and UA was better separated within 20 minutes，it had good linear relationship between peak area mass concentration between 0.02468～0.2468 mg/mL and 0.02523～0.2523 mg/mL with the correlation coefficient of 0.9994 and 0.9996 respectively.The recovery rates were 99.96%（RSD 0.74%）and 100.03%（RSD 0.95%）.Conclusion：The established method was simple，quick，accurate，and had better reproducibility for the determination of OA and UA in Rosa Multiflora Thunb.at the same time by HPLC.The content of OA and UA in fruits reached the highest value.The Rosa Multiflora Thunb.from Kuqa and Atux had the highest content of OA and UA，so that could be used as the origin for the research of Rosa Multiflora Thunb.

Rosa Multiflora Thunb.；oleanolic acid；ursolic acid；HPLC；quantitative determination

TS207.3

A

1002-0306（2016）06-0049-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.001

2015-07-21

古力齐曼·阿布力孜（1988-），女，在读硕士研究生，研究方向：天然产物，E-mail：1436607467@qq.com。

迪丽努尔·马里克（1964-），女，大学本科，教授，研究方向：天然产物，E-mail：pkudilnur@sina.com。

国家自然科学基金（21165018）项目资助；新疆少数民族科技人才特殊培养计划科研项目（201423121）资助；自治区自然科学基金特配项目（201523119）资助。