保护剂对真空冷冻干燥酸马乳粉中乳酸菌的影响

王 威，王小标，殷 娜，张亚南，杨波若，古丽娜孜，武 运，*（.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐8005；.昌吉市农产品质量安全检验检测中心，新疆昌吉800；.新疆农业大学科学技术学院，新疆乌鲁木齐8005）

保护剂对真空冷冻干燥酸马乳粉中乳酸菌的影响

王 威1，王小标2，殷 娜3，张亚南1，杨波若1，古丽娜孜1，武 运1，*
（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐830052；2.昌吉市农产品质量安全检验检测中心，新疆昌吉831100；3.新疆农业大学科学技术学院，新疆乌鲁木齐830052）

以真空冷冻干燥酸马乳粉中乳酸菌为考察对象，采用二水平部分析因设计和最陡爬坡实验筛选了3种乳酸菌冻干保护剂，并确定了中心组合实验的中心实验点。通过响应面实验优化得到3种冻干保护剂的最优添加量为麦芽糊精2.30%（W/V）、海藻糖3.50%（W/V）、α-环状糊精3.10%（W/V）。在此条件下，酸马乳粉中乳酸菌活菌数为（8.78±0.10）×108CFU/g。真空冷冻干燥酸马乳粉具有较高的乳酸菌活菌数与较佳的风味和品质，可为新疆地区马乳及其制品的加工提供一定的理论依据。

酸马乳粉，真空冷冻干燥，冻干保护剂，乳酸菌活菌数

发酵酸乳是一种含有大量活性乳酸菌，具有较高营养价值和医疗保健作用的乳制品，深受广大消费者的喜爱。发酵酸乳制品中乳酸菌的活菌数及其活性与发酵酸乳制品的医疗保健作用密切相关［1］。《GB 16321-2003乳酸菌饮料卫生标准》规定，未杀菌活性乳酸菌饮料出厂、运输、贮藏以及销售时乳酸菌活菌数应在1×106CFU/mL以上。有研究认为，益生菌发酵食品在货架期内乳酸菌活菌数应大于1×106CFU/mL，才能更好发挥乳酸菌益生作用［2］。然而，发酵乳制品在运输、贮藏、销售过程中需要全程冷链，否则会造成严重的后酸化现象，大大降低发酵乳中乳酸菌活菌数，以及发酵乳制品的风味和品质，缩短保质期［3-4］。将发酵乳通过冷冻干燥、喷雾干燥或者微波干燥等工艺加工成酸乳粉，在保持发酵乳制品风味及乳酸菌活菌数的同时，又可以延长产品货架期，同时不需要冷链参与，降低生产成本［5-6］。研究表明，与其他干燥方式相比，冷冻干燥制备的酸乳粉具有较高的活菌数和较好的风味［7-8］。陆婧采用冷冻干燥法制备的藏灵菇酸奶粉色泽均匀、疏松多孔，无结块具有典型的酸乳风味，而且藏灵菇酸奶粉中乳酸菌活菌数可达到2.12×108CFU/g［9-10］。

保护剂对液态乳的乳酸菌活性的影响研究较多，但在国内外，保护剂对真空冷冻酸马乳粉中乳酸菌活性的影响还未曾研究。因此，本实验以真空冷冻干燥酸马乳粉中乳酸菌为考察对象，通过二水平部分析因设计筛选出对真空冷冻干燥酸马乳粉中乳酸菌存活有显著影响的冻干保护剂，并通过最陡爬坡实验确定冻干保护剂的添加量范围，运用中心组合实验设计优化不同冻干保护剂的最优添加量，提高真空冷冻干燥酸马乳粉中乳酸菌活菌数，为新疆地区马乳加工产业的发展提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜马乳 购于新疆乌鲁木齐南山地区；干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）MLS5、乳酸乳球菌（Lactococus lactis）WLB5和马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromyces marxianus）WWMJ1 新疆农业大学食品科学与药学学院微生物实验室；MRS肉汤、改良MC培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）、孟加拉红培养基 青岛日水生物技术有限公司；乳清蛋白、海藻酸钠、木糖醇、α-环状糊精、海藻糖、麦芽糊精、乳糖醇、谷氨酸钠 郑州裕和食品添加剂有限公司。

FA2014N分析天平 北京东南仪诚实验室设备有限公司；HR40-IIA2生物安全柜 青岛海尔特种电器有限公司；YXQ-LS-18SI手提式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DHP-9052电热恒温培养箱、HWS-26电热恒温水浴锅、BYKFD-5真空冷冻干燥机 上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 二水平部分析因设计 通过二水平部分析因实验设计（Fractional Factorial Design，FFD）分别研究乳清蛋白、海藻酸钠、木糖醇、α-环状糊精、海藻糖、麦芽糊精、乳糖醇、谷氨酸钠对真空冷冻干燥酸马乳粉中乳酸菌的保护作用，并对实验结果进行回归分析，筛选对酸马乳粉中乳酸菌数有显著影响的冻干保护剂。二水平部分析因实验设计如表1所示。

表1 二水平部分析因设计因素与水平编码值Table1 Factors，levels，and codes of two level fractional factorial design

1.2.2 最陡爬坡实验 根据二水平部分析因实验设计的结果，依据对酸马乳粉中乳酸菌活菌数影响显著的冻干保护剂的回归系数确定相应的变化步长，运用最陡爬坡实验快速逼近酸马乳粉中乳酸菌活菌数最高的区域，从而确定各种保护剂的添加量范围。

1.2.3 中心组合实验 根据最陡爬坡实验结果，利用中心组合实验设计，以麦芽糊精、海藻糖和α-环糊精的添加量为考察因子，以酸马乳粉中乳酸菌活菌数为响应值，建立响应值与考察因子之间的二次多项回归模型。中心组合实验设计因素与水平编码值表见表2。

表2 中心组合实验设计因素和水平编码值Table2 Factors，levels，and codes of central composite design

1.2.4 检测指标

1.2.4.1 活菌计数 酸马乳中乳酸菌活菌计数采用改良MC琼脂培养基倾注培养，放置于37℃恒温培养箱中培养2 d；酸马乳中酵母菌活菌计数采用孟加拉红琼脂培养基涂布培养，放置于28℃恒温培养箱中培养2 d［11-12］。

1.2.4.2 酸马乳粉含水量的测定 酸马乳粉含水量的测定参照《GB 5009.3-2010食品中水分的测定》中直接干燥法［13］。

1.2.4.3 润湿下沉性 精确称取10.00 g酸马乳粉，均匀分散在40℃水面上，分别在静置和搅拌两种情况下测定酸马乳粉全部润湿下沉的时间［14］。

1.2.4.4 冲调性 用40℃水250 mL冲调34.00 g的酸马乳粉，搅拌后观察酸马乳的溶解性状［15］。

1.3 数据处理

实验数据利用Design-Expert 8.05软件对回归模型进行响应面优化，运用Sigmaplot 12.5绘制交互项三维响应面图，通过SPSS 19.0软件进行方差分析，p＜0.05具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 二水平部分析因设计结果

运用二水平部分析因设计实验分别考察乳清蛋白、海藻酸钠、木糖醇、麦芽糊精、海藻糖、α-环状糊精、乳糖醇、谷氨酸钠9种冻干保护剂对酸马乳粉中乳酸菌活菌数和冻干存活率的影响，结果如表3所示。

对表3二水平析因设计实验结果进行方差分析，结果如表4所示。由表4可知，在酸马乳粉真空冷冻干燥过程中，在α=0.05的显著性水平上，麦芽糊精、海藻糖添加量对酸马乳粉中乳酸菌的活菌数有极显著的影响，α-环状糊精添加量有显著影响，而且三种冻干保护剂对酸马乳粉中乳酸菌活菌数的影响均为正效应，可考虑作为主要因素进一步做响应面实验。对二水平部分析因设计结果进行一元线性回归分析，得到酸马乳粉中乳酸菌活菌数（Y）对麦芽糊精（D）、海藻糖（E）和α-环状糊精（F）多元一次方程为：Y= 8.74+0.035D+0.029E+0.022F。

表3 二水平部分析因设计及结果Table3 The experiment design and results of two-level partial factorial design

表4 二水平部分析因设计方差分析Table4 Analysis of variance of the two-level partial factorial design

2.2 最陡爬坡实验结果

由多元一次方程和相关系数可以看出，麦芽糊精（D）相关系数绝对值最大，因此选择麦芽糊精（D）作为变量来定义步长。定义ΔXD=1.00为1个步长，则ΔXE=（0.029/0.035）ΔXD=0.83，ΔXF=（0.022/0.035） ΔXD=0.63。自然变量步长的相应变化为ΔD=ΔXD［（1-0.5）/2］=0.25，ΔE=ΔXE［（2-1）/2］=0.42，ΔF=ΔXF［（2-1）/ 2］=0.32，考虑实际实验的方便性，调整麦芽糊精、海藻糖和α-环状糊精步长分别为0.3、0.4、0.3下进行最陡爬坡实验，实验设计及结果如表5所示。在第五组（0+4Δ）实验中，酸马乳粉中乳酸菌活菌数最高，即选取麦芽糊精添加量2.2%、海藻糖添加量3.6%、α-环状糊精添加量3.2%作为中心组合实验的中心点。

表5 最陡爬坡实验结果Table5 Results of the steepest ascent of experiment

2.3 酸马乳粉冻干保护剂响应面优化

2.3.1 响应面实验设计及结果 根据表6中心组合实验设计结果进行回归分析，得到酸马乳粉中乳酸菌活菌数（Y）对麦芽糊精（A）、海藻糖（B）和α-环状糊精（C）添加量的拟合方程为：Y1=8.94+0.0005A-0.028B-0.077C-0.064AB-0.051AC+0.0013BC-0.065A2-0.088B2-0.14C2。

表6 中心组合实验设计及结果Table6 Experimental design and results of the central composite design

表7 回归方程方差分析Table7 Analysis of variance of regression equations

由表7可以看出，本实验建立的回归模型F=30.92，p＜0.0001，表明回归模型极显著；而模型失拟项p= 0.3251＞0.05，说明模型失拟项不显著，由此说明所建立的模型具有良好的显著性。决定系数R2=0.9653，校正决定系数R=0.9341，表明该模型能较好拟合实际实验中响应值的变化，利用此模型可以对真空冷冻干燥酸马乳粉中乳酸菌活菌数进行分析和预测。从表7可以看出：在α=0.05的显著水平上，一次项C、交互项AB、AC和二次项A2、B2、C2对真空冷冻干燥酸马乳粉中乳酸菌活菌数的影响均为极显著（p＜0.01），一次项B对真空冷冻干燥酸马乳粉中乳酸菌活菌数存在显著的影响（p＜0.05）。

2.3.2 响应面分析与优化 利用Design-Expert 8.05软件对建立的回归模型进行响应面优化，运用Sigmaplot 12.5绘制交互项三维响应面图（图1～图3），可以比较直观看出麦芽糊精、海藻糖和α-环状糊精两两之间交互作用对真空冷冻干燥酸马乳粉中乳酸菌活菌数的影响。从图1可以看出，随着麦芽糊精含量的增大，活菌数呈现先增大后减小的趋势，整个曲面呈凸形，活菌数受海藻糖的影响大于麦芽糊精的含量；从图2可以看出，随着麦芽糊精含量的增大，活菌数呈现先增大后减小的趋势，曲面弧度很陡，二者交互作用对响应值的影响比较明显；从图3可以看出，随着海藻糖含量的增高，活菌数呈现先增大后减小的趋势，曲面弧度比较陡峭。通过Design-Expert 8.05对建立的回归方程进行参数最优化分析，可以得出酸马乳粉中乳酸菌活菌数最高时麦芽糊精、海藻糖和α-环状糊精的最佳添加量，即麦芽糊精2.28% （W/V）、海藻糖3.50%（W/V）、α-环状糊精3.10% （W/V）。在此条件下，酸马乳粉中乳酸菌活菌数预测值为8.9574 lg CFU/g。

图1 麦芽糊精与海藻糖交互作用响应面图Fig.1 Response surface for the effect of maltodextrin and trehalose on the viable count of LAB

图2 麦芽糊精与α-环状糊精交互作用响应面图Fig.2 Response surface for the effect of maltodextrin and α-cyclodextrin on the viable count of LAB

2.3.3 验证实验 为检验所建立的多元回归模型的准确性，同时考虑实验操作方便，在麦芽糊精2.30% （W/V）、海藻糖3.50%（W/V）、α-环状糊精3.10%（W/V）条件下进行酸马乳真空冷冻干燥实验，实验平行3次，得到的真空冷冻干燥酸马乳粉中乳酸菌活菌数平均值为（8.78±0.10）×108CFU/g，对数值为（8.9436±0.0051）lg CFU/g，与预测值较为接近，说明该模型准确可靠，能较好预测真空冷冻干燥酸马乳粉中乳酸菌活菌数。

图3 海藻糖与α-环状糊精交互作用响应面图Fig.3 Response surface for the effect of trehalose and α-cyclodextrin on the viable count of LAB

2.4 酸马乳粉的感官指标

测定最佳工艺条件下制备的酸马乳粉的感官指标，结果如表8所示。

提高酸马乳粉中乳酸菌活菌数主要有两条途径，一是提高发酵酸马乳中乳酸菌活菌数，二是提高真空冷冻干燥过程中乳酸菌的存活率。在酸马乳粉真空冷冻干燥过程中，乳酸菌细胞暴露在多种应力下，从而导致菌体细胞机械损伤、细胞膜的流动性和完整性改变，细胞内蛋白变性失活，尤其是一些重要的蛋白酶或抑制因子，破坏pH的动态平衡、DNA损伤等［16］。研究表明，添加冻干保护剂，不仅可以提高乳酸菌的冻干存活率，还可提高其在贮藏期间的稳定性［17］。

通过二水平部分析因设计筛选出麦芽糊精、海藻糖和α-环状糊精对酸马乳粉中乳酸菌的活菌数和冻干存活率有显著影响。海藻糖在冻干过程中对生物体和生物大分子的保护效果显著，常用作乳酸菌发酵剂的冻干保护剂。蒲丽丽等发现，在冷冻干过程中海藻糖对嗜热链球菌的冻干保护效果最好，而且嗜热链球菌细胞饱满，无变形、塌陷［18］。张玉华等发现，海藻糖可以与菌体蛋白和细胞膜磷脂的极性基团形成氢键，起到维持磷脂水化状态和蛋白质二级结构稳定的作用［19］。麦芽糊精和α-环状糊精均属于高分子冻干保护剂，在冻干过程中通过包裹菌体，使其免受外热源的热传导性和热辐射性伤害，与小分子的冻干保护剂配合使用，可以加速升华，加速干燥，在冻干和贮藏期间维持较高的乳酸菌细胞存活率［20］。

表8 酸马乳粉感官指标Table8 Sensory indexs of koumiss powder

酸马乳粉的含水量是重要的质量指标之一，一定的含水量可以保持酸马乳粉的品质，延长保质期，无论在质量和经济效益上均起很大的作用。有研究报道，奶粉要求含水量为3.0%～5.0%，不能超过此范围，若含水量大于5.0%，就易造成奶粉结块，则商品价值就低，含水量过高，奶粉易变色，贮藏期降低，可能导致营养素损失、微生物滋长、奶粉结块变质等问题。目前行业的平均水平控制在4.0%左右。

3 结论

通过二水平部分析因设计实验及最陡爬坡实验筛选出了对真空冷冻干燥酸马乳粉中乳酸菌活菌数和存活率影响显著的3种冻干保护剂，即麦芽糊精、海藻糖和α-环状糊精，并确定了中心组合实验中心实验点。利用Design-Expert 8.05软件对真空冷冻干燥酸马乳粉中乳酸菌活菌数进行响应面优化，得到3种冻干保护剂的最优添加量为麦芽糊精2.30%（W/V）、海藻糖3.50%（W/V）、α-环状糊精3.10%（W/V）。在此条件下制备的酸马乳粉中乳酸菌活菌数为（8.78±0.10）×108CFU/g。真空冷冻干燥酸马乳粉呈均匀乳白色，具有典型的酸马乳风味，结构疏松，无结块，冲调后无结块，杯底有少量蛋白质沉淀，含水量为3.93%。

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Effect of protective agents on lactic acid bacteria of koumiss powder by vacuum freeze-drying

WANG Wei1，WANG Xiao-biao2，YIN Na3，ZHANG Ya-nan1，YANG Bo-ruo1，GU Li-nazi1，WU Yun1，*
（1.College of Food Science and Pharmaceutical Science，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China；2.Agricultural Products Quality and Safety Inspection Center，Changji 831100，China；3.College of Science and Technology，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China）

In order to improve the viable count of lactic acid bacteria in koumiss powder produced by vacuum freeze-drying，3 kinds of freeze-drying protective agents were screened by two level fractional factorial design，and the central point of response surface experiment was confirmed by the steepest ascent experiment.The optimal additions of 3 freeze-drying protective agents were 2.30%（W/V）of maltodextrin，3.50%（W/V）of trehalose and 3.10%（W/V）of α-cyclodextrin.Under the optimal conditions，the viable count of lactic acid bacteria in koumiss powder was up to（8.78±0.10）×108CFU/g.The freeze-drying koumiss powder had higher viable count of lactic acid bacteria and good flavor and quality，which could provide theoretical basis for processing of mare's milk and its'production.

koumiss powder；vacuum freeze drying；freeze-drying protective agents；the viable count of lactic acid bacteria

TS252.42

A

1002-0306（2016）06-0206-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.034

2015－08－03

王威（1991-），男，硕士研究生，研究方向：食品生物技术，E-mail：928178182@qq.com。

武运（1965-），女，硕士，教授，主要从事食品生物技术与食品安全方面的研究，E-mail：wuyunster@sina.com。

新疆维吾尔自治区科技厅重大专项目（201130101-4（2）-2）；“十二五”国家科技支撑项目（2012BAD44B01-05）；新疆农业大学科学技术学院大学生创新项目（2015KCX03）。