响应面法优化同时蒸馏法萃取熏马肠中挥发性风味物质的研究

高 蕾，陈 恺，周建中，孔令明，李 蓉，杨海燕（新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐830052）

响应面法优化同时蒸馏法萃取熏马肠中挥发性风味物质的研究

高 蕾，陈 恺，周建中，孔令明，李 蓉，杨海燕*
（新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐830052）

使用同时蒸馏萃取法萃取熏马肠中挥发性风味物质，在单因素实验基础上采用Box-Behnken实验设计对提取条件进行优化。结果表明，使用二氯甲烷为提取溶剂，最佳萃取条件为提取时间156 min，溶剂用量50 mL，料液比1∶2.4，在此最优条件下提取量为875.63 mg/kg。气相色谱质谱联用法分析结果表明，熏马肠挥发性风味物质主要含55种化合物，有酚类、醇类、烯烃类、烷烃类、脂类、醛酮类、含氮含硫及杂环化合物，其中酚类物质含量较高占提取总含量的52.66%，为熏马肠主要的风味物质。

熏马肠，同时蒸馏萃取-气质联用法，挥发性风味物质，响应面优化

马肉具有较高的营养价值，其不饱和脂肪酸含量达58.5%～62.0%，蛋白质含量达20%～24%，且含有20多种氨基酸，铁含量较高，分别是牛羊肉的8～9倍，猪肉的5～6倍，而胆固醇含量仅为2.48%［1］。熏马肠制品主要通过干腌法进行腌制再经过低温熏制而成，有独特的风味，是极受欢迎的新疆特色食品之一［2］。目前对马肉制品的研究主要集中在传统工艺生产熏马肠及质量控制，传统熏马肠及西式熏马肠的加工工艺及营养价值，发酵马肉中乳酸菌的分离筛选等加工工艺流程方面［3-4］，其制作工艺、风味物质种类及形成机理的系统研究相对匮乏，因此造成产品质量评价困难，生产工艺参数控制粗放，产品品质波动较大等问题，生产规模难以扩大，无法形成行业标准，使新疆马肉制品产业的发展规模受到制约。

挥发性风味物质提取方法中应用较为广泛的有同时蒸馏萃取法（Simultaneous Distillation Extraction，SDE）、超临界CO2萃取法（Supercritical Carbon Dioxide Fluid Extraction，SFE）、固相微萃取（Solid Phase Microextraction，SPME），不同提取方法其优缺点不同。与SFE和SPME方法相比，SDE法通过同时加热样品及有机溶剂至沸腾，将挥发性风味物质的水蒸汽蒸馏与溶剂萃取同时进行。其操作简便，分析时间短，在溶剂用量较少情况下即可得到很好的提取效果，广泛运用于食品分析、香精香料、药物化学等行业的样品分析前处理中。谢章斌等［5］用同时蒸馏提取法提取鹅肥肝中的挥发性风味物质，并用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）与气相色谱-嗅觉测量法（GC-O）进行检验。陈红霞等［6］用同时蒸馏提取法和顶空固相微萃取法提取兔肉中的挥发性风味物质并用GC-MS进行检验。董智哲等［7］采用固相微萃取法和同时蒸馏萃取两种方法对海南地区香草兰豆荚中挥发性成分进行检测分析。熏马肠具有特殊的风味，高温蒸煮为其主要食用方式，因此使用SDE法可充分提取检测熏马肉制品的挥发性风味物质。

挥发性特征风味是熏马肠特点之一，是评价质量的重要指标，也是其特征指标。本研究基于Box-Behnken法进行实验设计并通过响应面分析法优化SDE萃取条件，以最优条件提取熏马肠的挥发性风味物质并采用气相色谱质谱联用技术对其进行分析，以期为熏马肠的生产工艺改进提供参考，对进一步鉴定熏马肠特征风味物质具有指导作用和实践意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

马肉 新疆昭苏县绿源食品有限责任公司；三聚磷酸钠、六偏磷酸钠、焦磷酸钠、亚硝酸钠、二氯甲烷、石油醚、正戊烷、正己烷、无水Na2SO4等化学试剂 均为分析纯，购于阜瑞生物器材公司；癸酸乙酯、二氯甲烷等化学试剂 均为色谱纯，购于阜瑞生物器材公司。

AL204-IC型电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；BCD-219SKD型冰箱 青岛海尔股份有限公司；FW-100型高速万能粉碎机 北京市永光明医疗仪器厂；同时蒸馏萃取装置 长城玻璃仪器公司定制；DZKW-D-2型电热恒温水浴锅 北京永光明医疗仪器厂；ITQ900 GC/MS气相色谱/质谱联用仪 美国PE公司。

1.2 实验方法

1.2.1 新疆传统熏马肠的制作工艺流程［2］马肉→切块（100 mm×30 mm×20 mm，200 g）→配料（食盐、亚硝酸钠等）→腌制（24 h）→切丁→灌制→烟熏（6 h）→蒸煮（2 h）→冷却→真空包装→杀菌冷却→成品→常温贮藏。

1.2.2 同时蒸馏萃取法 称取经粉碎机粉碎熏马肠样品25.0 g（精确到0.1 g）置于1000 mL样品瓶中并加入蒸馏水，量取萃取溶剂置于溶剂瓶中，萃取完毕后溶剂装入棕色样品瓶加入适量的无水Na2SO4静置密封，放置于-18℃冰箱过夜，0.45 μm过滤膜过滤后冷藏。

1.2.3 单因素实验 通过前期预实验及资料查阅［5-8］，考察萃取溶剂种类、提取时间、溶剂用量、料液比4个因素，对SDE法提取熏马肠挥发性风味物质提取量的影响。

1.2.3.1 溶剂种类对熏马肠风味物质提取总量的影响 分别称取熏马肠25.0 g，以料液比为1∶3，提取时间为150 min，溶剂用量50 mL条件下考察石油醚、正己烷、二氯甲烷、正戊烷四种不同溶剂对熏马肠风味物质提取总量的影响。

1.2.3.2 溶剂用量对熏马肠特征风味物质提取总量的影响 分别称取熏马肠25.0 g，以料液比为1∶3，提取时间为150 min，使用溶剂为二氯甲烷，分别设定溶剂用量为40、50、60、70、80 mL，考察溶剂不同用量对熏马肠风味物质提取总量的影响。

1.2.3.3 提取时间对熏马肠特征风味物质提取总量的影响 分别称取熏马肠25.0 g，以料液比为1∶3，溶剂用量为50 mL，使用溶剂为二氯甲烷，分别设定75、90、105、120、135、150、165、180 min，考察不同提取时间对熏马肠风味物质提取总量的影响。

1.2.3.4 料液比对熏马肠特征风味物质提取总量的影响 分别称取熏马肠25.0 g，以提取时间为150 min，溶剂用量为50 mL，使用溶剂为二氯甲烷，分别设定1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6 g/mL为料液比，考察不同料液比对熏马肠风味物质提取总量的影响。

1.2.4 响应法实验设计 在单因素实验的基础上，考虑各因素对熏马肠挥发性风味物质提取量的影响，选择提取时间（A）、溶剂用量（B）、料液比（C）为三因素，根据Box-Behnken中心组合实验设计，通过Design-Expert 8.0.6软件，以挥发性风味物质提取量（mg/g）为响应值，进行二次回归分析设计实验，确定最佳提取条件。实验因素水平设计表见表1。

表1 响应面实验因素水平表Table1 Factors and levels design of the response surface methodology

1.2.5 GC-MS条件及分析方法 气相色谱柱：Hp-5毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；氢火焰离子化（FID）检测器。升温程序：起始温度40℃，保持5 min；以5℃·min-1，上升至70℃，保持5 min；接着以2℃·min-1，上升至90℃，保持3 min；再以3℃·min-1，上升至180℃，保持3 min；最后以5℃·min-1，上升至240℃，保持10 min；不分流方式进样，进样量1 μL；载气：N2。

质谱条件：离子源为EI源，离子源温度为200℃，电子能量为70 eV，扫描范围m/z为33.0～500.0。

根据检测所得谱图使用计算机检索与NIST library对照相匹配进行初步检索及资料分析进行定性分析。考察SDE法提取熏马肠挥发性风味物质及其响应面优化阶段，化合物定量方法为内标法［9］，采用癸酸乙酯为内标进行定量分析，公式为：化合物浓度（mg/kg）=（化合物峰面积/内标物峰面积）×内标浓度。使用GC-MS对最优方法所提取挥发性风味物质分析阶段，根据峰面积归一化法确定各个成分的相对峰面积百分含量。

1.2.6 数据处理 每次实验设3个平行样，取平均值，使用Excel 2010处理数据。使用Box-Behnken中心组合实验设计方案，通过Design-Expert 8.0.6软件及结合方差分析对数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 SDE法提取熏马肠挥发性风味物质单因素实验

2.1.1 溶剂种类对熏马肠风味物质提取总量的影响

在料液比、提取时间、溶剂用量一定情况下，通过查阅相关文献及前期预实验选择石油醚、正己烷、二氯甲烷、正戊烷为提取溶剂，实验结果见图1。二氯甲烷萃取效果最好，分析原因为二氯甲烷对极性强的化合物具有强选择性。正戊烷虽然沸点（36.1℃）与二氯甲烷沸点相近，但提取量较低。正己烷为溶剂时，萃取量较低，效果不佳，由于正己烷的沸点比二氯甲烷高，低沸点化合物损失较大。石油醚为轻质石油产品，是相对分子质量低的烷烃类混合物，其中含有少量不饱和烃，沸点与烷烃相近，用蒸馏法无法分离。四种溶剂对熏马肠风味物质提取总量存在显著差异，所以采用二氯甲烷作为提取溶剂。

图1 不同溶剂对熏马肠风味物质提取总量的影响Fig.1 Effect of different kinds of solvent on total extraction of flavor compounds determination in smoked horsemeat

2.1.2 溶剂用量对熏马肠特征风味物质提取总量的影响 在料液比、提取时间一定情况下，使用不同用量二氯甲烷对熏马肠风味物质进行提取，实验结果见图2。由图2可知，所提取的风味物质总量有显著差异，二氯甲烷用量为50 mL时风味物质提取量最大，但当溶剂用量分别增加为60、70、80 mL时提取总量没有显著变化，因此选择50 mL溶剂用量进行后续实验。

图2 溶剂用量对熏马肠风味物质提取总量的影响Fig.2 Effect of the volume of solvent on total extraction of flavor compounds determination in smoked horsemeat

2.1.3 提取时间对熏马肠特征风味物质提取总量的影响 在料液比、溶剂用量一定情况下，使用二氯甲烷对熏马肠风味物质进行提取，实验结果见图3。随着提取时间的增加，提取总量不断增加，当提取时间增至150 min时，提取总量为最大值。但进一步增加提取时间至165 min时，提取总量呈下降趋势。因此选择最佳提取时间为150 min

图3 提取时间对熏马肠风味物质提取总量的影响Fig.3 Effect of time on total extraction of flavor compounds determination in smoked horsemeat

2.1.4 料液比对熏马肠特征风味物质提取总量的影响 由图4可知，不同料液比对风味物质提取总量的影响有明显差异，当料液比为1∶3时提取的风味物质总量较高，进一步增加水量后提取量有一定减少。分析原因为料液比较小时，物料无法充分浸没在水中从而形成粘稠物，影响了提取效果。当料液比过大时，提取总量有所下降，分析原因为物料大量漂浮在水面无法充分浸润，提取初期物料吸水量过低对提取效果有一定影响，所以选择料液比为1∶3。

图4 料液比对熏马肠风味物质提取总量的影响Fig.4 Effect of material-liquid ratio on total extraction of flavor compounds determination in smoked horsemeat

2.2 响应面法优化SDE法萃取熏马肠风味物质条件

以提取量为响应值，对熏马肠挥发性风味物质的提取量进行响应面分析，实验方案及结果见表2，方差分析结果见表3。

使用Design Expert 8.0软件进行数据多元回归拟合，可得到总峰面积对提取时间（A）、溶剂用量（B）、料液比（C）的二次多项回归模型：

由表3可知，回归模型极显著（p=0.0007＜0.01）而失拟项不显著（p=0.1912），因此该模型拟合程度良好；模型的确定系数R2=0.9823，信噪比（S/N）=17.101，

表2 实验设计方案及结果Table2 The experimental results and response surface design arrangement

表3 回归分析结果Table3 Results of regression analysis

说明该模型可信度较高，可使用此模型对熏马肠样品挥发性风味物质进行提取。同时，A、C、A2、B2、C2对结果的影响均为极显著（p＜0.01），因此可得出对提取量影响的大小依次为：料液比、提取时间和溶剂用量。交互项的p＞0.01，表明三个因素的交互作用对于熏马肠挥发性风味物质的提取影响不显著。

由回归方程并考虑实际情况修正后得到的最佳条件为提取时间156 min，溶剂用量50 mL，料液比1∶2.4。在此条件下进行三次验证实验，得到提取量为875.63 mg/kg，接近模型预测值894.09 mg/kg。

2.3 熏马肠特征风味物质的定性分析

根据上述实验获得的最佳实验条件及实验方法进行熏马肠风味物质的提取，并使用GC-MS分析得出总离子流色谱图，如图5所示。对质谱图数据库进行检索，所确定的化合物种类、相对含量及出峰时间见表4。

图5 熏马肠挥发性组分的GC-MS总离子流色谱图Fig.5 Total ion current chromatogram of smoked horsemeat extract

在熏马肠中检测出55种不同的化合物，其中有酚类、醇类、烯烃类、烷烃类、酯类、醛酮类、含氮含硫及杂环化合物。烟熏对提高肉制品的香气有明显作用，熏烟成分因所用木材种类差异而有不同，但木材燃烧时木质素的降解可形成酚类物质，此类物质是熏制食品的主要特征风味物质［10-11］。此次从熏马肠中分离出来并经鉴定的酚类有8种，占提取物总含量的49.25%。其中2，2'-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）含量最高，占总量的39.35%、愈疮木酚（邻甲氧基苯酚）2.69%、4-甲基愈创木酚2.39%、4-乙基愈创木酚0.65%、苯酚1.85%、茴香脑1.47%、2，4-二甲基苯酚0.59%、2，4-二叔丁基苯酚0.26%，可见熏马肠制品的主要特征风味物质为酚类物质。

醇类也是熏马肠中挥发性风味物质中含量较多的化合物，其含量占总挥发性物质的16.17%。包括支链醇、芳香醇、二醇、烯醇等，其来源主要与脂类物质的氧化降解及熏制所用木材种类有关。醇类化合物含量比较多的是4-萜烯醇，占总挥发性成分的6.11%，其呈暖的胡椒香、较淡的泥土香及木材气息。

表4 熏马肠同时蒸馏样品的挥发性组分GC-MS分析结果Table4 The result of GC-MS of identified flavor compounds of smoked horsemeat

续表

烯烃和烷烃分别占挥发性总成分的6.25%和6.97%。烃类化合物主要来源于组织脂肪酶对脂肪的水解，生成游离脂肪酸。游离脂肪酸进一步氧化降解，生成大量烃类、烯烃类物质。熏马肠风味物质中的脂肪烃类物质所占的比例较大，但由于其呈味阈值较高，一般认为此类物质对肉制品的风味贡献不大［12］。芳香烃类物质、烯烃类则有一定风味贡献，如检出的萜品烯具有柑橘香味，α-蒎烯有松木、针叶及树脂样的气息等。

含氮含硫及杂环化合物占3.78%，主要是由于熏马肠为自然发酵型肉制品，加工过程中由于细菌和酶的作用，使蛋白质分解产生氨以及胺类等碱性含氮物质［13-14］。少量的多环芳烃主要来源于烟熏过程中木材的不完全燃烧并在熏马肠表面沉积的物质。

熏马肠是通过自然发酵并熏制而成的肉制品，其挥发性风味物质的形成受熏制木材种类、熏制工艺的影响较大［2］。此次检测出的含量较高的酚类物质及烯烃类物质的种类均与熏制木材有一定相关性。同时，SDE法萃取的挥发性风味物质主要为低挥发性、高沸点的成分，在萃取过程中样品经过长时间高温蒸煮，使部分结构不稳定的物质不能被检出，经分析得出的风味物质种类仅为55种。因此结合顶空固相微萃取法（HS-SPME）可进一步对熏马肠挥发性风味物质进行全面分析。

3 结论

同时蒸馏萃取法（SDE）将蒸馏与萃取同时进行，操作简便、高效，对熏马肠中挥发性风味物质的提取效果较好。实验结果表明：料液比对熏马肠特征风味物质提取的影响最显著，二氯甲烷用量影响最小。确定最优提取条件为：提取时间156 min，溶剂用量50 mL，料液比1∶2.4，得到提取量为875.63 mg/kg，通过气相色谱-质谱联用法对熏马肠中挥发性风味物质进行分析和鉴定，共分析得55种化合物，占提取总含量的52.66%的酚类物质含量较高，为熏马肠主要的风味物质。

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Optimization of SDE extraction conditions for the flavor compounds in smoked horsemeat by response surface analysis

GAO Lei，CHEN Kai，ZHOU Jian-zhong，KONG Ling-ming，LI Rong，YANG Hai-yan*
（College of Food Science and Pharmaceutics，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，Chian）

The flavor compounds in smoked horsemeat were extracted by simultaneous distillation extraction （SDE），the extraction technology was optimized by Box-Behnken central design on the basis of single factor experiment.The results showed that when dichloromethane was used as extraction solvent，the optimal extraction conditions as follows：extraction time 156 min，volume of solvent 50 mL，material-liquid ratio 1∶2.4，using the optimal conditions，the extracting yield of flavor compounds in smoked horsemeat was 875.63 mg/kg.The gas chromatography-mass spectrometer（GC-MS）analysis showed that total 55 volatile flavor compounds were identified in smoked horsemeat，including phenols，alcohols，alkenes，alkanes，and lipid，aldehydes and ketones，and N-，S-containing and heterocyclic compounds.The major flavor compound in smoked horsemeat was phenols，the content of which was 52.66%.

smoked horsemeat；SDE/GC-MS；flavor compounds；response surface methodology

TS201.1

A

1002-0306（2016）06-0052-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.002

2015-05-06

高蕾（1980-），女，硕士，讲师，研究方向：农产品加工及综合利用，E-mail：lei_gao17@163.com。

杨海燕（1962-），女，博士，教授，主要从事农产品加工及综合利用方面的研究，E-mail：yanghaiyan163@163.com。

新疆农业大学校前期资助课题（XJAU201207）；自治区重大专项子课题［201130101-4（2）］。