日内瓦毛霉对妊娠烯醇酮的生物转化研究

孙工兵（黑龙江金九药业股份有限公司，黑龙江 密山 158306）

·论著·

日内瓦毛霉对妊娠烯醇酮的生物转化研究

孙工兵
（黑龙江金九药业股份有限公司，黑龙江 密山 158306）

目的探索日内瓦毛霉微生物对妊娠烯醇酮的生物转化问题。方法将妊娠烯醇酮经生物转化后，发生7-羟基化，得到两种产物，通过红外、核磁、质谱分析，确定其化学结构进行优化研究。结果碳源、氮源对转化率的影响很大，试验最佳的碳源、氮源确定为葡萄糖和蛋白胨，辅助氮源为酵母膏。结论通过单因素条件优化，确定碳源和氮源加量分别为3.6%和1.3%。对不同浓度无机盐KH2PO4对转化率的影响，确定其浓度为0.16%，初始pH为4.5时，最终得到主产物的转化率为59.2%。

甾体；妊娠烯醇酮；日内瓦毛霉；羟基化

在临床应用上，甾体激素是一类重要的激素药物，广泛的应用归因其生理活性［1］，这种作用活性于C11上的羟基化作用关系密切。

20世纪50年代美国普强药厂利用微生物黑根霉的羟化酶将黄体酮一步转化成11α-羟基黄体酮［2］，即对甾体化合物结构的改造，这一方法成功地解决了皮质激素合成中的最大难题，使微生物转化技术成为甾体药物不可缺少的关键技术。先令公司开发成功的口服避孕药Yasmin（屈螺酮加炔雌醇），在美国和欧洲早已上市，7a，15α-二羟基雄烯醇酮是合成屈螺酮的重要中间体，直接转化方法简单，副产物少［3］。研究表明，去氢表雄酮（DHEA）的7-羟基衍生物对治疗癌症和阿尔茨海默病有重要疗效，同时它还具有抗糖皮质激素作用、增强机体免疫功能和促进减肥功效［4］。

本研究选择日内瓦毛霉对妊娠烯醇酮生物转化的研究，对转化条件进行了优化的同时，获得了具有超强生物活性潜力的7-羟基甾体衍生物。7-羟基甾体衍生物的产率得到了进一步的提高，为新药的开发和设计奠定了良好的基础。

1　材料

1.1菌种：日内瓦毛霉（M.genevensis），自筛，经中国微生物菌种保藏管理委员会，农业微生物中心（ACCC）鉴定为日内瓦毛霉。

1.2培养基：分离培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，少量甾体；酵母膏培养液：蛋白胨12 g/L，葡萄糖40 g/L，磷酸二氢钾1.3 g/L，酵母膏1 g/L，用1 mol/L HCl调pH为4.5；斜面培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，pH为4.5。

2　方法

2.1薄层层析（TLC）：称取27 g硅胶G置具塞三角瓶中，加3 g石蜡和50 mL三氯甲烷，制备成0.25 mm厚的硅胶薄层层析板（75 mm×25 mm）；浓硫酸∶甲醇=1∶1为显色剂；丙酮∶石油醚=1∶3（V/V）作展开剂。样品用上行法展开，将层析板浸于显色液中取出，用电吹风机吹干，吹干后用显色剂喷雾，放在电热板上加热显色。

2.2菌种分离筛选：标本采集：在选好适当地点后，取1 g土壤置于已灭菌的试管中，加10 mL无菌水，漩涡振荡器振荡摇匀，静置，取上清液，滴于培养基中，再用玻璃棒涂匀。置27℃恒温培养箱中培养1～5 d后，从分离培养基中挑出单菌落，在相同条件下继续培养1～5 d后，将纯化的菌株移置到斜面培养基上，编号保存。将甾体底物进行发酵培养，用薄层层析技术检测，选出具有转化甾体能力的优良菌株。将初筛后得到的菌株再次进行甾体转化试验，复筛出转化甾体效果更好的菌株。

2.3甾体转化试验：取1支斜面菌种，用接种针将菌种加入已灭菌的装有发酵液100mL的锥形瓶中。27℃，220 r/min振荡培养2 d，将1.5 g妊娠烯醇酮溶于30 mL丙酮中，在每瓶已生长的菌液中加入2 mL丙酮溶液，相同条件下继续发酵培养4 d。

2.4甾体转化产物的分离与分析：用乙酸乙酯将发酵液和菌丝体，减压蒸馏萃取6次后，合并有机相，真空旋转蒸发仪蒸去溶剂，真空干燥，柱层析分离，得到产物粗品后，以MS、IR和2D-NMR波谱技术鉴定结构。

3　结果

3.1菌种的分离与筛选：细菌、放线菌和真菌均具有甾体羟基化作用的微生物，我们用从土壤中筛选出的菌种进行发酵试验，筛选时选用妊娠烯醇酮作为底物，最终获得了转化能力强、效果较好的菌株日内瓦毛霉。

3.2甾体生物转化产物的分离：在用硅胶柱层析技术分离产物时，曾经选用了丙酮-石油醚、丙酮-二氯甲烷、丙酮-氯仿、氯仿-乙酸乙酯、氯仿-甲醇等体系进行试验。结果发现，在妊娠烯醇酮（1）的生物转化中，以丙酮∶石油醚（1∶3）作展开剂，可以成功地将混合物分开，效果良好。

3.3日内瓦毛霉对妊娠烯醇酮的转化：妊娠烯醇酮在用Mucor genevensis进行生物转化时，生成7α，11α-二羟基妊娠烯醇酮2和7α，11β-二羟基妊娠烯醇酮3。通过红外、质谱分析、核磁等方法，确定其化学结构分别是7α和11α-二羟基妊娠烯醇酮2，7α和11β-二羟基妊娠烯醇酮3，详见表1。

表1　硅胶柱层析技术分离产物的理化常数结

3.4日内瓦毛霉培养基组成的优化

3.4.1不同葡萄糖浓度对转化率的影响：试验结果表明，当葡萄糖浓度为3.5%时，转化率最高，详见表2。

表2　葡萄糖浓度对转化率的影响（%）

3.4.2不同氮源对转化率的影响：试验结果表明，用酵母膏为氮源，转化率为最高。但由于酵母膏和蛋白胨各有优缺点：酵母膏成分复杂、价格较贵、称重时难控制，蛋白胨价格相对便宜、称重时易控制，因此该试验以蛋白胨为主要氮源，酵母膏为辅助氮源，详见表3。

表3　不同氮源对转化率的影响（%）

3.4.3蛋白胨浓度对转化率的影响：结果表明，当蛋白胨浓度1.4%时，转化率最大，详见表4。

表4　蛋白胨浓度对转化率的影响（%）

3.4.4KH2PO4浓度对转化率的影响：研究结果表明，当KH2PO4浓度为0.16%时，转化率最大，详见表5。

表5　KH2PO4浓度对转化率的影响（%）

3.4.5培养基初始pH对转化率的影响：培养基的初始pH影响产物的转化。因此，羟基化酶反应体系的pH以4.5效果最好，详见表6。

表6　初始pH对转化率的影响（%）

4　讨论

从土样中筛选到1株能转化甾体的菌株，经鉴定为日内瓦毛霉菌株。本文研究日内瓦毛霉对妊娠烯醇酮的生物转化方面进行了研究。通过利用红外和二维核磁波谱技术，确定日内瓦毛霉化学结构为7α，11α-二羟基妊娠烯醇酮和7α，11β-二羟基妊娠烯醇酮。日内瓦毛霉对妊娠烯醇酮的羟基化反应发生在C-7位上，并具有位置专一性。

同时对培养基组成进行优化研究。研究了不同碳源、氮源对妊娠烯醇酮的转化率的影响，确定葡萄糖和蛋白胨为试验最佳碳源和氮源，酵母膏为辅助氮源，单因素试验确定其含量分别为3.5%和1.4%；研究了无机盐KH2PO4不同浓度对转化率的影响，确定其浓度分别为0.16%，初始pH为4.5时，最终得到主产物转化率是：59.2%。日内瓦毛霉能够专一性地对妊娠烯醇酮经行羟基化反应，这为研究妊娠烯醇酮药物开发及体内代谢研究提供一定的理论依据。

［1］杨灿宇，杜连祥.甾体C11α-羟化菌株AF9612发酵条件的研究［J］.天津轻工业学院学报，1999，23（2）：45-48.

［2］Wang J，Chen CZ，Li BA，et al.Enzyme Microb Technol ［J］.1998，22（3）：368-373.

［3］尚珂，胡海峰，朱宝泉.微生物转化法合成7α，15α-二羟基雄烯醇酮［J］.中国医学生物技术应用，2004，33 （2）：30-34.

［4］Phelan A，Elliott C，O'Hare P.Intercellular delivery of functional p53 by the herpesvirus protein VP22［J］.Nat Biotechnol，1998，16（4）：440-443.

Bio-Transformation of Pregnenolone by Mucor Genevensis

Sun Gongbing
（Heilongjiang Jinjiu Pharmaceutical Company Limited，Mishan 158300，China）

Microbial transformation of pregnenolone was studied in the Mucor genevensis culture，in which 7α，11α-dihydroxypregnenolone and 7α，11 β-dihy droxypregnenolone were given from the metabolites.The biotransformation products were determined by IR，NMR and MS analysis.The results showed that the optimal condition for the biosynthesis of 7α，11α—dihydr-roxypregnenolone was as follows：3.5%dextrose，1.4%peptone，0.16%potassium dihydydrogen phosphate，initial pH 4.5.The yield of 7α，11α-dihydroxypregnenolone was 59.2%.

Steroids；Biotransformation；Pregnenolone；Hydroxylation

R917

A学科分类代码：31047

1001-8131（2016）04-0401-03

黑龙江省农垦总局基金资助（HNK12KF-24）；大庆科技局科研项目（szd201126）

2016-03-01