抗单增李斯特菌枯草芽孢杆菌C3增菌培养条件优化

刘宽博，熊利霞*，刘　慧，张红星（.北京农学院 食品科学与工程学院，微生态制剂关键技术开发北京市工程实验室，食品质量与安全北京实验室，北京 02206；2.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025）

抗单增李斯特菌枯草芽孢杆菌C3增菌培养条件优化

刘宽博1，2，熊利霞1*，刘慧1，张红星1
（1.北京农学院 食品科学与工程学院，微生态制剂关键技术开发北京市工程实验室，食品质量与安全北京实验室，北京 102206；2.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025）

枯草芽孢杆菌对单增李斯特菌有强烈抑制作用，该文对其增菌培养基和培养条件进行优化，为今后将其应用于食品和饲料奠定基础。在对培养基成分和培养条件进行单因素试验的基础上，设计5因素4水平正交试验对培养基成分进行优化。结果表明，培养基成分优化为葡萄糖1.0%，酵母浸粉1.0%，NaCl 0.5%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.2%，培养条件优化为pH5.4，装液量50 mL/250 mL，接种量3%，温度37℃，150 r/min培养14 h，在此条件下，活菌数可达到7.1×1010CFU/mL，比优化前提高了7.89倍。

枯草芽孢杆菌C3；李斯特菌；增菌培养基；培养条件；优化

单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）简称单增李斯特菌，被世界卫生组织（World Health Organization，WHO）列为第四大重要的食源性致病菌［1］，广泛分布于自然界，可污染多种食品（如生家禽、家畜肉、海产品和发酵香肠等［2］），可导致败血症、脑膜炎以及胃肠炎等［3］，该菌引起的死亡率达到20%～30%［4］，在欧美和日本等国家，单增李斯特菌造成的临床疾病以及食物中毒超过以往占第一位的沙门氏菌。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种“公认安全（generally recognized as safe，GRAS）”的食品级有益微生物［5］，已经广泛应用于防治植物病害、养殖业、环境修复、医学方面等领域［6］，但在食品防腐保鲜方面研究报道较少。目前，关于细菌素的研究主要集中在乳酸菌上［7］，国内关于枯草芽孢杆菌对单核细胞增生性李斯特菌的抑菌研究报导较少，许红岩等［8］从土壤分离的枯草芽孢杆菌的发酵液可有效抑制单核细胞增生性李斯特菌。

传统肉制品大多都通过人工合成的化学防腐剂来进行保鲜，具有一定的安全隐患，使用不当会有一定副效应，长期过量摄入会对消费者的身体健康造成一定损害，而且造成环境污染。因此，研发高效、安全、环境友好的天然肉制品防腐剂是农产品安全的迫切需要。细菌素是由某些细菌产生的一类抑菌物质，是由细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类多肽类物质［9］。在人体内可降解，具有高效、无抗药性、无毒、无残留等优点，已成为天然食品生物防腐剂研究与开发的热点［10-11］。

枯草芽孢杆菌C3产抗单增李斯特菌细菌素，理化性质稳定，发酵液中的细菌素效价为640 AU/mL，在食品保藏方面具有一定的应用潜力。本研究旨在通过优化该菌的增菌培养基和培养条件，使活菌数最大化，为今后该菌的进一步研究和开发应用奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌种

枯草芽孢杆菌C3：由食品质量与安全北京实验室课题组筛选并保存，经微量生化反应与16s DNA方法鉴定为Bacillus subtilis。

1.1.2培养基

基础活菌数液体培养基［12］：蛋白胨1.0%，酵母浸粉0.5%，NaCl 1.0%，pH自然，蒸馏水1 000 mL。

活菌平板计数培养基（plate count agar，PCA）［13］：胰蛋白胨0.5%，酵母浸粉0.25%，葡萄糖0.1%，琼脂1.5%，蒸馏水1 000 mL。

液体活菌数培养基［14］：葡萄糖1.0%，蛋白胨1.0%，NaCl 1.0%，KH2PO40.15%，MgSO4·7H2O 0.15%，pH自然，蒸馏水1 000 mL。

1.1.3主要试剂

蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、七水合硫酸镁、氢氧化钠、氯化钠、磷酸二氢钾（均为纯分析）：北京化工厂；乳糖、酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、平板计数琼脂：北京陆桥技术有限责任公司。

1.2仪器与设备

BS224S型精密电子天平：德国Sartorius集团；HS-3B型雷磁便携式酸度计：上海雷磁仪器厂；MLS-3750型全自动高压蒸汽灭菌锅：日本SANYO公司；WS-01恒温恒湿培养箱：湖北黄石恒丰医疗器械有限公司；THZ-C空气浴摇床：太仓市试验设备厂。

1.3方法

1.3.1培养方法

菌种活化：将于-80℃冰箱保藏的枯草芽孢杆菌C3菌种取出，室温解冻后用移液枪移取1 mL接种到装有50 mL（接种量2%）枯草芽孢杆菌种子液培养基的250 mL三角瓶中，37℃、150 r/min摇床培养12 h后获得一代枯草芽孢杆菌种子，再从一代枯草芽孢杆菌种子液中以同样的条件活化后获得二代枯草芽孢杆菌种子液，并镜检纯度。

1.3.2枯草芽孢杆菌C3生长曲线的测定

在基础活菌数液体培养基中，除培养时间外，其他培养条件同1.3.1，分别培养0、2 h、4 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h，每时间点设3瓶重复，以确定枯草芽孢杆菌C3的最佳培养时间。

1.3.3枯草芽孢杆菌C3培养条件优化

初始pH的筛选：基础活菌数液体培养基的成分不变，将pH分别调至自然（5.4）、6.5、7.0、7.5，培养条件同1.3.1，每个处理重复3次，用PCA培养基进行活菌计数，以活菌数为考察指标筛选最佳pH。

不同装液量的筛选：在250 mL三角瓶中，基础活菌数液体培养基的装液量分别为40 mL、50 mL、60 mL、70 mL，除装液量外，其他培养条件同1.3.1，每个处理重复3次，用PCA培养基进行活菌计数，以活菌数为考察指标筛选最佳装液量。

不同接种量的筛选：在基础活菌数液体培养基中，除接种量外，其他培养条件同1.3.1，接种量分别为1%、2%、3%、4%，每个处理重复3次，用PCA培养基进行活菌计数，以活菌数为考察指标筛选最佳接种量。

1.3.4枯草芽孢杆菌C3增菌培养基优化单因素试验

碳源对活菌数的影响：基础活菌数液体培养基中，除葡萄糖外，其他成分和培养条件不变，分别添加1.0%麦芽糖、蔗糖、乳糖代替基础活菌数液体培养基中的葡萄糖，每个处理重复3次，进行活菌计数，以活菌数为考察指标筛选最佳碳源。

氮源对活菌数的影响：基础活菌数液体培养基中，除酵母浸粉外，其他成分和培养条件不变，分别添加0.5%蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨代替基础活菌数液体培养基的酵母浸粉，每个处理重复3次，进行活菌计数，以活菌数为考察指标筛选最佳氮源。

无机盐对活菌数的影响：基础活菌数液体培养基中，除NaCl外，另添加KH2PO4作为调节因子［15］，其他成分和培养条件不变，分别添加0.5%CaCl2、KCl、MgSO4·7H2O代替基础种子液培养基的NaCl，每个处理重复3次，进行活菌计数，以活菌数为考察指标筛选最佳无机盐。

1.3.5枯草芽孢杆菌C3增菌培养基优化正交试验

在单因素试验的基础上，根据参考文献［16-19］将葡萄糖、酵母浸粉及NaCl、MgSO4·7H2O和KH2PO4调至不同含量进行5因素4水平正交试验，以活菌数为考察指标，研究碳源、氮源及无机盐的含量对枯草芽孢杆菌C3活菌数的影响，正交试验设计的因素和水平见表1。

表1　培养基成分优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test for proliferation medium composition optimization %

1.3.6测定方法

活菌数的测定：参照GB 4789.2—2010《菌落总数测定》方法进行。

2　结果与分析

2.1枯草芽孢杆菌C3生长曲线

图1　枯草芽孢杆菌C3的生长曲线Fig.1 Growth curve ofB.subtilis C3

枯草芽孢杆菌C3的生长曲线（图1），枯草芽孢杆菌C3经过2 h的延缓期后进入对数生长期，在14 h时活菌数到达最大，为2.3×109CFU/mL，然后呈下降趋势，在20 h时枯草芽孢杆菌C3的活菌数降至7.3×108CFU/mL，故确定枯草芽孢杆菌的培养时间为14 h。

2.2枯草芽孢杆菌C3培养条件的单因素优化

2.2.1初始pH对活菌数的影响

图2　初始pH对活菌数的影响Fig.2 Effects of different initial pH on viable cell ofB.subtilisC3

不同初始pH对活菌数的影响结果（图2），初始pH为自然（5.4）、6.5、7.0、7.5时的活菌数分别为3.25×109CFU/mL、8.0×108CFU/mL、1.4×109CFU/mL、2.2×109CFU/mL，当初始pH值为自然时活菌数最高，故确定活菌数培养基的较优初始pH为自然。

本研究中，当pH自然时为5.4左右，活菌数最高，这与FURZIKOVA T M等［16］的研究报告相驳，其指出pH7～9是枯草芽孢杆菌的最适酸碱环境，这说明枯草芽孢杆菌的菌株差异很大，本次试验的枯草芽孢杆菌C3的生长pH比较特殊，这在今后的研究中应加以重视。

2.2.2装液量对活菌数的影响

不同装液量对活菌数的影响结果（图3），在250 mL三角瓶中装液量分别为40mL、50mL、60mL、70mL时，枯草芽孢杆菌C3活菌数分别为3.1×108CFU/mL、6.6×109CFU/mL、5.7×108CFU/mL、6.6×108CFU/mL，即装液量为50mL/250mL时活菌数最高，达6.6×109CFU/mL，故确定活菌数培养基的装液量为50 mL/250 mL。其原因可能是枯草芽孢杆菌为好氧菌，在接种量相同的条件下，单位体积内菌数多，氧气消耗量也大，故装液量过多，不利于该菌的生长代谢，最适装液量为50 mL/250 mL。

图3　装液量对活菌数的影响Fig.3 Effects of different fluid volume on viable cell of B.subtilisC3

2.2.3接种量对活菌数的影响

图4　接种量对活菌数的影响Fig.4 Effects of different inoculum on viable cell ofB.subtilisC3

不同接种量对活菌数的影响结果（图4），接种量分别为1%、2%、3%、4%时，枯草芽孢杆菌C3活菌数分别为4.6×108CFU/mL、5.2×108CFU/mL、4.8×109CFU/mL、3.4×108CFU/mL，即接种量为3%时活菌数最高，达4.8×109CFU/mL，故确定活菌数培养基的接种量为3%。接种量过小，迟缓期长，生长相对缓慢，接种量太大，在固定的培养时间内，有可能已经进入衰亡期，故接种量应为3%。

2.3枯草芽孢杆菌C3增菌培养基单因素优化试验

2.3.1碳源对活菌数的影响

不同碳源对活菌数的影响（图5）可知，当碳源分别为葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖时，枯草芽孢杆菌C3活菌数分别为8.6×109CFU/mL、6.5×109CFU/mL、5.1×108CFU/mL、2.5×108CFU/mL，即碳源为1.0%葡萄糖时活菌数最高，故确定活菌数培养基的较优碳源为葡萄糖。

图5　碳源对活菌数的影响Fig.5 Effects of different carbon sources on viable cell of B.subtilisC3

2.3.2氮源对活菌数的影响

图6　氮源对活菌数的影响Fig.6 Effects of different nitrogen sources on viable cell of B.subtilisC3

不同氮源对活菌数的影响（图6）可知，当氮源分别为蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸粉时，枯草芽孢杆菌C3活菌数分别为3.7×108CFU/mL、3.1×108CFU/mL、4.7×108CFU/mL、2.7×109CFU/mL，即氮源为0.5%酵母浸粉时活菌数最高，故确定活菌数培养基的较优氮源为酵母浸粉。酵母浸粉不但可以提供氮源，而且其营养丰富，还可为菌体生长提供维生素，利于菌体生长。

2.3.3无机盐对活菌数的影响

图7　无机盐对活菌数的影响Fig.7 Effects of different inorganic salt on viable cell of B.subtilisC3

不同无机盐对活菌数的影响（图7）可知，无机盐分别为0.5%NaCl、CaCl2、KCl、MgSO4·7H2O时，枯草芽孢杆菌C3活菌数分别为1.1×109CFU/mL、0.2×108CFU/mL、4.9×108CFU/mL、1.4×109CFU/mL，即无机盐为0.5% MgSO4·7H2O时活菌数最高，无机盐为NaCl时活菌数也较高，综合考虑，确定活菌数培养基的较优无机盐为MgSO4·7H2O、NaCl，另添加KH2PO4作为调节因子。

2.4枯草芽孢杆菌C3增菌培养基优化正交试验

营养成分对枯草芽孢杆菌C3活菌数影响优化正交试验结果见表2。

表2　培养基成分优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test for proliferation medium composition optimziation

从表2直观分析通过可以看出，5个因素对活菌数的影响由大到小依次是RA＞RC＞RB＞RE＞RD，即葡萄糖＞NaCl＞酵母浸粉＞MgSO4·7H2O＞KH2PO4，得到的最佳组合是A2B2C1D4E4，即葡萄糖1.0%，酵母浸粉1.0%，NaCl 0.5%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.2%。由于最佳组合不在试验的16组数据中，故需要对最佳组合进行验证试验。

在正交试验最优组合条件下，其活菌数达7.1×1010CFU/mL，高于正交试验的处理组6的活菌数6.7×1010CFU/mL，比优化前活菌数提高了7.89倍。与闫沛迎等［17-19］的试验结果相比也有较大提高。

3　结论

在单因素试验基础上，采用正交试验考察了葡萄糖、酵母浸粉、NaCl、KH2PO4、MgSO4·7H2O对枯草芽孢杆菌C3活菌数的影响。结果表明，培养基最佳组合为葡萄糖1.0%，酵母浸粉1.0%，NaCl 0.5%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.2%。培养条件为pH 5.4，装液量50 mL/250 mL，接种量3%，温度37℃，150 r/min培养14 h。在此条件下，活菌数达7.1×1010CFU/mL，比优化前活菌数提高了7.89倍。

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Optimization of proliferation medium composition and fermentation conditions of against Listeria monocytogenes by Bacillus subtilis C3

LIU Kuanbo1，2，XIONG Lixia1*，LIU Hui1，ZHANG Hongxing1
（1.Beijing Engineering Laboratory of Probiotics Key Technology Development，Beijing Laboratory of Food Quality and Safety，College of Food Science and Engineering，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China；2.School of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

Bacillus subtilishasstrong inhibitory effect onListeria monocytogenes，the proliferation medium and culture condition of bacteriocin against L.monocytogenesbyB.subtilisC3 were optimized，which will be probably applied in food and feed in the future.On the basis of single factors on the proliferation medium and fermentation conditions，orthogonal experiments with 5 factors and 4 levels was conducted to optimize the number of viable cells ofB.subtilisC3.The results showed that the optimal medium composition was glucose 1.0%，yeast extract powder 1.0%，NaCl 0.5%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.2%，and the optimal fermentation conditions were initial pH 5.4，fermentation medium with fluid volume of 50 ml/250 ml，inoculum 3%，fermentation temperature 37℃，shaker speed 160 r/min，fermentation time 14 h.Under the optimized conditions，the number of viable cells ofB.subtilisC3 can reach 7.1×1010CFU/ml，which increased 7.89 times.

Bacillus subtilisC3；Listeria monocytogenes；proliferation medium；fermentation conditions；optimization

TS201.1

0254-5071（2016）02-0048-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.011

2015-12-07

北京市教委面上项目（KM201410020010）；北京市属高等学校高层次人才引进与培养计划（CIT&TCD20140315）

刘宽博（1993-），女，硕士研究生，研究方向为食品科学。

熊利霞（1975-），女，讲师，博士，研究方向为食品微生物及其代谢产物的利用。