双水相提取黄芪茎总黄酮及其抗氧化活性研究

钟方丽，王文姣，2，王晓林*，姚丽丽

（1.吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林吉林 132022；2.吉林大学化学学院，吉林长春130012）

双水相提取黄芪茎总黄酮及其抗氧化活性研究

钟方丽1，王文姣1，2，王晓林1*，姚丽丽1

（1.吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林吉林 132022；2.吉林大学化学学院，吉林长春130012）

试验探索了微波协同双水相法提取黄芪茎总黄酮的工艺条件并对其体外抗氧化活性进行研究。采用单因素试验和正交试验对黄芪茎中总黄酮的提取工艺进行优化；通过对超氧阴离子自由基的清除率和还原力对其抗氧化活性进行评价。结果表明，微波协同双水相提取黄芪茎总黄酮的最佳工艺条件为料液比1∶27，微波功率400 W，醇水比0.67，提取时间7 min，硫酸铵质量浓度0.27 g/mL；黄芪茎总黄酮提取液的抗氧化活性随提取液用量的增加而逐渐增强，其对超氧阴离子自由基的清除率可以达到82%，而且具有较强的还原力。

黄芪茎；总黄酮；双水相；抗氧化

［Abstract］The test was conducted to study the extraction technology of total flavonoids in astragalus stems with aqueous two-phase assisted with microwave method and its antioxidant ability.The single factor and orthogonal tests were applied to optimize the extraction technology of total flavonoids in astragalus stems.The antioxidant ability of the extracts was evaluated according to the clearance ratio and reducing power to superoxide anion free radical.The optimum extraction technology of total flavonoids in astragalus stems with aqueous two-phase assisted with microwave method was obtained. The ratio between material and solvent，the microwave power，the ratio between ethanol and water，extraction time，mass concentration of ammonium sulfate were 1∶27，400 W，0.67，7 min，0.27 g/mL，respectively.The clearance ratio of the total flavonoids extraction solution of astragalus stems to superoxide anion free radical could reach 82%，antioxidant activity of which gradually enhanced with the increase of the amount of the extraction solution.

［Key words］astragalus stems；total flavonoids；aqueous two-phase；antioxidant activity

黄芪是我国传统的中草药材。研究表明，黄酮是黄芪中一类重要的活性成分，具有调节免疫、抗炎、抗突变、清除自由基等多种活性作用（陈建真等，2009）。黄芪的传统应用部位是根部，但黄芪茎的产量远远大于黄芪根（杨春树，1997）。目前，我国大部分黄芪茎被废弃，未被有效利用，资源浪费严重（毕志明等，2007）。研究表明，饲料中添加黄芪茎粉后，对鸡、兔具有明显的促生长和增强免疫能力作用，能够提高畜禽的生产性能（王凤霞等，2009）。双水相体系是一种新型的分离技术，具有工艺条件温和、生物亲和性好等优点，已广泛应用于天然产物中活性物质的分离 （欧阳玉祝等，2011）。本试验将微波辅助提取法与双水相体系结合提取黄芪茎总黄酮，并考察了黄芪茎总黄酮提取液的抗氧化活性。

1　材料与方法

1.1材料与仪器试验材料：黄芪茎，购于吉林省均林中草药种植有限公司；芦丁对照品（成都曼思特生物科技有限公司）；三羟甲基氨基甲烷（天津市科密欧化学试剂有限公司）；水为重蒸馏水；石油醚、亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝、硫酸铵、铁氰化钾、无水乙醇等均为国产分析纯试剂。

试验仪器：TU-1810型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；MAS-Ⅱ型常压微波辐射萃取仪 （上海新仪微波化学科技有限公司）；FA2004N型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；KQ118型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DHG-9076A型电热鼓风干燥器（上海精密实验设备有限公司）。

1.2试验方法

1.2.1线性关系考察及样品中总黄酮含量的测定参照江蔚新等（2004）和李春红等（2011）的黄芪总黄酮含量测定方法，精密称取120℃干燥至恒重的芦丁对照品10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加入60%乙醇溶液溶解并定容，摇匀，配制成每毫升含0.20 mg对照品的溶液。精密吸取上述对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加入5%NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，加入10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，加入4%NaOH溶液4.0 mL，用60%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，放置15 min，以相应的试剂为空白对照，按照分光光度法，在510 nm波长处测定其吸光度。

1.2.2单因素提取试验

1.2.2.1醇水比对提取效果的影响设定双水相总体积为50 mL，加入硫酸铵13.5 g，分别设定醇水比为0.47、0.57、0.67、0.77、0.87，形成稳定的双水相体系，加入脱脂的黄芪茎粉2 g，于微波功率500 W提取5 min，过滤，滤液于分液漏斗中静置分层，上层乙醇相以相应浓度的乙醇溶液定容，吸取乙醇适量，按1.2.1的方法测定总黄酮含量，计算总黄酮提取率。

总黄酮提取率/%=提取液中总黄酮质量/黄芪茎粉质量×100。

1.2.2.2硫酸铵质量浓度对提取效果的影响设定双水相总体积为50 mL，选择醇水比为0.67，加入无水乙醇20 mL、蒸馏水30 mL，分别加入硫酸铵7.5、10.5、13.5、16.5、19.5 g，硫酸铵质量浓度分别为0.15、0.21、0.27、0.33、0.39 g/mL，形成稳定的双水相体系，在上述条件下试验并测定提取液总黄酮含量，计算总黄酮提取率。

1.2.2.3微波提取时间对提取效果的影响设定双水相总体积为50 mL，选择醇水比为0.67，加入硫酸铵13.5 g，形成稳定的双水相体系，微波功率为500 W，微波辅助提取时间分别为1、3、5、7、10、15 min，在上述条件下试验并测定提取液总黄酮含量，计算总黄酮提取率。

1.2.2.4料液比对提取效果的影响固定醇水比为0.67，料液比分别设定为1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40，硫酸铵质量浓度为0.27 g/mL，微波功率为500 W，微波辅助提取7 min，在上述条件下试验并测定提取液总黄酮含量，计算总黄酮提取率。

1.2.2.5微波功率对提取效果的影响固定醇水比为0.67，料液比为1∶25，加入硫酸铵13.5 g，形成稳定的双水相体系，设定微波功率分别为300、400、500、600、700、800 W，微波辅助提取7 min，在上述条件下试验并测定提取液总黄酮含量，计算总黄酮提取率。

1.2.3正交试验通过单因素试验结果可知，醇水比为0.47～0.87对提取率影响最小，所以选取提取时间、料液比、硫酸铵质量浓度、微波功率4个因素，进行L9（34）正交试验对黄芪茎总黄酮提取条件进行优化。正交试验因素与水平见表1。

表1　正交试验因素与水平

1.2.4验证性试验为了考察上述优选的双水相提取工艺的稳定性，按优化的提取工艺条件，即醇水比为0.67、微波提取时间7 min、料液比1∶25，硫酸铵质量浓度0.30 g/mL、微波功率400 W，重复提取3次，计算总黄酮提取率。同时吸取固定体积的上层乙醇相制成干浸膏，计算干浸膏中总黄酮的含量。

1.2.5对比试验称取脱脂处理后的黄芪茎粉2 g，加入40%乙醇水溶液50 mL，设定微波功率为400 W，微波辅助提取7 min，过滤，测定提取液总黄酮含量，计算总黄酮提取率。同时吸取固定体积的提取液制成干浸膏，计算干浸膏中总黄酮的含量。

1.2.6体外抗氧化性试验

1.2.6.1清除超氧阴离子自由基试验参照罗秋水等（2015）的试验方法，分别吸取5.6 mL Tris-HCl缓冲液（50 mmoL/L，pH 8.2）置于10 mL具塞试管中，分别加入总黄酮浓度为0.0386 mg/mL的黄芪茎提取液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，并以同质量浓度、同体积的维生素C溶液作对照，置于25℃水浴中保温20 min后急速冷却，然后加入25℃预热过的3 mmoL/L邻苯三酚溶液0.4 mL，混匀，反应4 min后加入8 mmoL/L HCL溶液1.0 mL终止反应，加蒸馏水至刻度，在320 nm波长处测其吸光度A0；空白试验以同体积蒸馏水代替样品溶液，以5.6 mL Tris-HCl缓冲液、8 mmoL/L HCL溶液1.0 mL及不同体积样品溶液为空白，在320 nm波长处测定其吸光度Ax。

O2-·清除率/%=（A0-AX）/A0×100。

1.2.6.2还原力试验参照吕喜茹等（2010）的试验方法，分别吸取上述黄芪茎提取液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，加入磷酸盐缓冲溶液（0.2 moL/L，pH=6.6）2.5 mL和1%铁氰化钾溶液 ［K3Fe（CN）6］2.5 mL，混合均匀后将该体系置于50℃恒温水浴中恒温20 min，迅速冷却，加入10%的三氯乙酸溶液1.0 mL，5000 r/min离心10 min，移取2.5 mL上清液于另一试管中，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液，混匀，静置10 min，以80%的乙醇溶液为空白对照，在700 nm波长处测定吸光度A。其他条件不变，用蒸馏水替代供试品溶液，在700 nm波长处测定吸光度A0，A与A0的差值越大表示供试品溶液的还原能力越强。

相对还原力=A－A0；

式中：A为加入黄芪茎提取液的吸光值，A0为不加黄芪茎提取液的对照值。

2　结果与分析

2.1线性关系考察以芦丁对照品溶液的吸光度值为纵坐标，质量浓度（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，回归方程：A=11.815C-0.0355，r=0.9996。结果表明，芦丁浓度为0.02～0.10 mg/mL呈良好线性关系。

2.2单因素提取试验

2.2.1醇水比对提取效果的影响由图1可知，当醇水比为0.47～0.87时，总黄酮提取率先随着醇水比的增大而提高，当醇水比为0.67时提取率达到最高值0.558%，继续增加醇水比，提取率开始下降，但整体而言在0.47～0.87时醇水比对总黄酮提取率的影响不是很显著。

图1　醇水比对提取结果的影响

2.2.2硫酸铵质量浓度对提取效果的影响由图2可知，硫酸铵质量浓度为0.15～0.39 g/mL时，总黄酮提取率先逐渐增大后开始降低，当硫酸铵质量浓度达到0.27 g/mL时，总黄酮提取率达到最高值，当硫酸铵质量浓度超过0.27 g/mL后，水相产生了盐析效应而使提取率开始下降。

图2　硫酸铵质量浓度对提取效果的影响

2.2.3微波提取时间对提取效果的影响由图3可知，随提取时间的增加，总黄酮的提取率先逐渐增大后降低，7 min时达到最高值0.634%。可能是因为某些黄酮类化合物受热时间过长，结构被破坏所致。

图3　提取时间对提取结果的影响

2.2.4料液比对提取效果的影响料液比太小，提取不完全；料液比太大，溶剂用量多，会造成分相盐硫酸铵用量增大，影响双水相的稳定性，导致总黄酮提取率降低。由图4可知，当料液比为1∶20时，总黄酮提取率达到最高值0.634%。

图4　料液比对提取效果的影响

2.2.5微波功率对提取效果的影响由图5可见，总黄酮提取率在微波功率由300 W增加到400 W时，达到最高值0.660%，而后随着微波功率的增高而逐渐下降，可能是因为微波功率超过一定值以后，短时间内会引起部分黄酮结构被破坏所造成的。

图5　微波功率对提取效果的影响

2.3正交试验通过正交试验结果可知，4种因素对黄芪茎总黄酮提取率的影响大小顺序为B＞D＞A＞C，即料液比＞微波功率＞提取时间＞硫酸铵质量浓度。黄芪茎总黄酮的最佳提取工艺条件是A2B2C3D2，即醇水比0.67、微波提取时间7 min、料液比1∶25、硫酸铵质量浓度0.30 g/mL，微波功率为400 W（表2）。

表2　正交试验结果

2.4验证性试验3次重复性工艺验证试验得出的黄芪茎总黄酮提取率分别为 0.7654%、0.7834%、0.8063%，平均为0.7850%，RSD为2.60%；干浸膏中总黄酮的含量分别为12.10%、11.79%、12.14%，平均为12.01%，试验结果表明经过单因素及正交试验优选的提取工艺条件稳定，适合规模化生产。

2.5对比试验在不加入分相盐硫酸铵的条件下，按照最优提取工艺提取3次，结果黄芪茎总黄酮提取率分别为0.8094%、0.7878%、0.7988%，平均为0.7987%；干浸膏中的总黄酮的含量分别为7.97%、8.02%、8.52%，平均为8.17%。通过试验结果可知，由于分相盐硫酸铵的加入，可使干浸膏中的总黄酮的含量明显提高，对黄芪茎中的黄酮类成分起到了一定的富集作用。

2.6体外抗氧化性试验

2.6.1清除超氧阴离子自由基试验由图6可知，试验结果表明：在所选样品液用量范围之内，黄芪茎总黄酮提取液和维生素C溶液清除超氧阴离子自由基的能力随着用量的增大，其清除能力也越来越强，在用量低于3 mL时黄芪茎总黄酮提取液的清除率明显高于维生素C溶液，但当用量高于3 mL时，随着样品液用量的增加维生素C溶液的清除率增加趋势显著，而黄芪茎总黄酮提取液的清除率提高趋势平缓，原因可能是黄芪茎提取液的总黄酮含量较低所造成的。黄芪茎总黄酮提取液清除超氧阴离子自由基活性研究结果表明，黄芪茎总黄酮提取液具有一定的抗氧化活性作用，如果对其采取纯化手段，使其总黄酮含量提高，则其抗氧化活性会明显提高。

图6　清除超氧阴离子自由基的能力

2.6.2还原力试验由图7可知，黄芪茎总黄酮提取液和维生素C溶液的还原力随着用量的增加而越来越强。在用量小于3 mL时黄芪茎总黄酮提取液的还原力高于维生素C溶液，但随着样品液用量的增加，维生素C溶液还原力的增加幅度明显高于黄芪茎总黄酮提取液，当样品液用量增加到5 mL时，维生素C溶液还原力开始高于黄芪茎总黄酮提取液。研究表明，黄芪茎总黄酮提取液具有明显的还原作用。

图7　还原力试验结果

3　结论

3.1通过单因素试验和正交试验对黄芪茎总黄酮的提取工艺进行优化，得出黄芪茎总黄酮的最佳提取工艺条件为醇水比0.67，料液比1∶25（g/mL），微波提取时间7 min，硫酸铵质量浓度0.30 g/mL，微波功率400 W。将微波协同双水相最佳提取工艺下得到的黄芪茎提取溶液制成干浸膏，总黄酮含量为12.01%，而将不加入分相盐硫酸铵的微波提取条件下得到的黄芪茎提取溶液制成干浸膏，总黄酮含量为8.17%，由于分相盐的加入，干浸膏的总黄酮含量提高了47%。

3.2当总黄酮质量浓度为0.0386 mg/mL时，黄芪茎总黄酮提取液的还原力和对超氧阴离子自由基的清除率随着用量的增加而提高，而且在用量低于3 mL时黄芪茎总黄酮提取液的还原力和对超氧阴离子自由基的清除率明显高于维生素C溶液。试验结果说明黄芪茎总黄酮提取液具有一定的抗氧化能力。

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S816.7

A

1004-3314（2016）11-0010-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161103