芪桂益脉灵对大鼠急性心肌缺血模型P38及ERK 1/2蛋白表达的影响

徐京育， 张超越， 赵 龙

芪桂益脉灵对大鼠急性心肌缺血模型P38及ERK 1/2蛋白表达的影响

徐京育1， 张超越2， 赵 龙2

（1.黑龙江中医药大学附属第一医院心血管病四科， 黑龙江 哈尔滨 150040 2.黑 龙 江 中 医 药 大 学 研 究 生 学 院， 黑龙江 哈尔滨 150040）

目的：观察芪桂益脉灵对大鼠急性心肌缺血模型心肌组织中P38及ERK1/2蛋白表达的影响。方法：取SD大鼠50只，随机分为5组，空白对照组灌服生理盐水后不做任何处理，假手术组灌服生理盐水后，开胸暴露左冠状动脉，穿线但不作结扎，其余大鼠分别分成单纯缺血再灌注组、芪桂益脉灵低剂量组和芪桂益脉灵高剂量组，分别给生理盐水、芪桂益脉灵（大、小剂量），连续灌服7d，并且结扎冠状动脉左前降支造成急性心肌梗死模型，造模成功后，取其心脏组织用中性福尔马林固定。用免疫组化法检测心肌组织P38和ERK1/2的蛋白表达水平。结果：单纯缺血再灌注组P-P38和P-ERK1/2与假手术术组比较蛋白表达升高（P＜0.05）；灌药组与单纯缺血再灌注组比较，P-P38表达明显降低，PERK1/2表达升高显著（P＜0.05），高剂量组效果更佳。结论：芪桂益脉灵能够抑制P38通路，减轻其磷酸化，并且能够升高ERK1/2磷酸化水平，减轻炎症因子的产生，减少心肌细胞的凋亡，能够协同减轻缺血再灌注损伤。

芪桂益脉灵； 心肌缺血再灌注； P38丝裂原活化蛋白激酶； ERK1/2细胞外信号调节激酶

P38丝裂原活化蛋白激酶家族是体内重要的信号传导通路之一［1，2］，ERK1/2细胞外调节激酶也是调节细胞凋亡和生存信号通路的重要部分。目前已发现的MAPK信号通路至少有3条，即EAK通路、JNK通路以及P38MAPK通路。EAK主要是由有丝分裂刺激源激活，而P38主要由应激刺激及炎症因子刺激下激活［3］。前期实验研究表明，芪桂益脉灵能抑制急性缺血再灌注损伤大鼠模型血管细胞粘附分子-1和微血管细胞间粘附分子-1的表达，减轻由炎症导致的血管损伤，保护心脏功能。本研究，将进一步探讨，芪桂益脉灵对心肌缺血再灌注损伤P38和ERK1/2信号通路的影响。

1 资料与方法

1.1 动物与分组：健康雄性SD大鼠50只，体重200～250g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供［许可证号：SCXK（黑）2013-004］。将大鼠随机分为5组，每组10只，最终入组8只。空白组每天清晨空腹灌服2mL生理盐水、假手术组每天清晨空腹灌服生理盐水2mL、单纯缺血再灌注组每天清晨空腹灌服生理盐水2mL、芪桂益脉灵低剂量组每天清晨空腹灌服芪桂益脉灵0.6g/kg 2 mL、芪桂益脉灵高剂量组每天清晨空腹灌服芪桂益脉灵1.2 g/kg 2 mL。

1.2 主要试剂：芪桂益脉灵中药复方，由党参，黄芪，黄连，三七，苦参，龙齿，桂枝，麦冬，五味子，炒枣仁组成，药物来自江阴天江药业有限公司，每毫升相当于生药1.25mg；Sc-7149（兔一抗）试剂盒，sc-101759（兔一抗）试剂盒，pv-9001（兔二抗）试剂，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。BS-3016R HPR（兔一抗）试剂、BS-0022R HPR（兔二抗）试剂，均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 主要设备及仪器：①小动物呼吸机（DH-150浙江大学医学仪器厂生产）；②心电机（ECG-1150型，上海光电医用电子仪器有限公司）；③低温冰箱（日本三洋公司）；④电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；⑤NiKon E200光学显微镜（日本）；⑥冰冻切片机。

1.4 模型制备：SD大鼠饲用20%乌拉坦（1g/kg）腹腔麻醉固定于手术台上并监测心电，气管切开，连小动物呼吸机，潮气量为12ml，呼吸频率为90次/min，呼吸比为1：1。从胸骨左缘3、4肋间开胸，钝性分离打开心包膜，充分的暴露心脏；于左心耳和肺动脉圆锥之间，经左冠状动脉前降支下浅层心肌穿过一条丝线，两端穿一条聚乙烯塑料管，末端用小动脉夹固定，最后将心脏送回胸腔。通过夹紧、打开小动脉夹造成冠状动脉的缺血和再通。记录冠状动脉前降支结扎前后及再通后心电图。空白组：只开胸，不穿线，不结扎；假手术组：开胸、只穿线但不结扎；单纯缺血再灌注组：末次灌药后1h行左主冠状动脉结扎60min，再灌注180min；芪桂益脉灵高、低剂量组造模方法与单纯缺血再灌注组相同。造模成功评判标准：心电图示：S-T段拱背向上抬高；反复灌注后出现心律失常。

1.5 p38、ERK1/2的检测：实验结束后，取大鼠心脏，采用0.9%的氯化钠溶液冲洗，用4%中性福尔马林固定，采用免疫组化法检测。检测步骤如下：①脱蜡、水化组织切片；②根据应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理；③3%H2O2去离水孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶；④PBS冲洗，2min3次；⑤滴加一抗，室温或37度孵育1～2h，PBS冲洗，3次/2min。⑥滴加试剂1，37度孵育10～20min，2min PBS冲洗3次；⑦滴加试剂2，37度孵育10～20min，PBS 2min冲洗3次；⑧应用DAB溶液显色⑨用生理盐水，进行充分冲洗、复染、脱水、透明、封片。见图1、图2。

1.6 统计学处理：应用SPSS19.0统计软件包进行数据整理，所有资料以均数±标准差（¯x±s）的形式表示，多组间比较用单因素方差分析，组间差异比较用SNK -q检验，以P＜0.05具有统计学意义。

2 结 果

2.1 P38和P-P38实验结果：实验各组大鼠心肌组织中P38蛋白表达较稳定，无显著差异，组间差异无统计学意义（P＞0.05）；假手术组与空白组相比，大鼠心肌病理情况并无明显差异，肌纤维排列相对规则，细胞核椭圆形，间质未见明显异常，P-P38蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05），说明不结扎不引起P38MAPK信号通路的激活；缺血再灌注组与空白组和假手术组比较，心肌纤维出现断裂溶解，间质出现水肿且增大，P-P38蛋白表达升高，有统计学意义（P＜0. 05），说明心肌缺血再灌注能够使P38MAPK信号通路激活，使其磷酸化，也进一步表明造模的成功；芪桂益脉灵组与单纯缺血再灌注相比，心肌间质水肿减轻，心肌纤维排列较为规则，P-P38蛋白表达下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；高低剂量组比较，高剂量组心肌组织水肿现象减轻的更加明显，P-P38降低更明显（P＜0.05），说明芪桂益脉灵能够抑制P38MAPK磷酸化水平，对缺血心肌具有保护作用，高剂量组效果更佳。

2.2 ERK1/2和P-ERK1/2实验结果：实验各组大鼠心肌组织中ERK1/2蛋白表达较稳定，无显著差异，组间差异无统计学意义（P＞0.05）；假手术组与空白组相比，大鼠心肌病理情况并无明显差异，肌纤维排列相对规则，细胞核椭圆形，间质未见明显异常，P-ERK1/2蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05），说明不结扎不能激活ERK1/2信号通路。

2.3 缺血再灌注组与空白组和假手术组比较，心肌纤维出现断裂溶解，间质出现水肿且增大，P-ERK1/2蛋白表达升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），说明心肌急性缺血再灌注损伤能够激活ERK1/2信号通路，提高其磷酸化水平，也表明造模的成功；芪桂益脉灵组与单纯缺血再灌注相比，心肌间质水肿减轻，PERK1/2蛋白表达水平升高，差异有统计学意义（P＜0. 05）；高低剂量组比较，高剂量组心肌组织水肿现象减轻的更加明显，P-ERK1/2升高更显著（P＜0.05），说明芪桂益脉灵能够提高P38MAPK磷酸化水平，对缺血心肌具有保护作用，高剂量组效果更佳。

表1 各组大鼠心肌组织P38 P-P38 ERK1 /2 P-ERK1 /2 蛋白水平的比较s）

表1 各组大鼠心肌组织P38 P-P38 ERK1 /2 P-ERK1 /2 蛋白水平的比较s）

注：灌药组与单纯缺血再灌注组比较均P＜0.05，高剂量组与低剂量组比较P＜0.05

组别　n　P38　P-p38　ERK1/2　P-ERK1/2空白组　8　0.80±0.25　1.23±1.12　0.75±0.05　0.32±0.03假手术组　8　0.82±0.09　2.55±1.43　0.75±0.05　0.38±0.02单纯缺血再灌注组　8　0.84±0.30　13.69±3.65#　0.82±0.12　0.78±0.13◇芪桂益脉灵低剂量组　8　0.82±0.14　7.90±2.09#△○　0.81±0.14　2.12±0.11◇☆★芪桂益脉灵高剂量组　8　0.78±0.21　5.16±1.63#△○　0.82±0.21　2.31±.0.21◇☆★

图1 P-P38组图

图2 P-ERK1/2组图

3 讨 论

近年来，血运重建术迅速发展和推广应用，已经成为冠状动脉粥样硬化性心脏病治疗的重要手段之一，该法能够迅速让缺血心肌恢复血流供应，但在此同时，又会造成相关损伤［4］。目前中药对缺血再灌注损伤心肌影响效应及机制研究主要有以下几个方面：①调控凋亡基因，拮抗细胞凋亡；②减少白细胞聚集，拮抗粘附分子表达；③改善心血管内皮细胞功能，调节血管活性因子活性；④保护细胞线粒体，改善细胞能量代谢；⑤抑制心肌细胞氧自由基、抗氧化；⑥抑制心肌细胞钙超载；⑦干预MIRI期间的炎症反应。中药能多靶点，多途径对缺血再灌注损伤的发挥护作用［5］。有研究表明，内皮损伤是心肌缺血再灌注损伤的关键因素，粘附分子是介导内皮损伤的重要环节，而P38MAPK信号通路在调控粘附分子的转录和表达过程中起到重要作用，缺氧等应急刺激、炎性因子等作用于内皮细胞使P38MAPK磷酸化激活，损伤内皮细胞，可见，抑制P38信号通路，能对心肌细胞起保护作用［6］。

ERK1/2是调节细胞凋亡及生存信号通路的重要部分，该通路的激活对缺血心肌保护有重要的作用，它可以抑制心肌细胞的凋亡、防止心肌细胞的坏死。有研究发现，ERK1/2通路的激活，可参与蛋白质和糖原的合成、葡萄糖的摄取和细胞的存活等多个细胞过程，心肌缺血后可引起 ERK1/2活性降低，所以提高ERK1/2活性，可以抑制细胞凋亡，起到心肌保护作用［7］。故本实验从细胞凋亡入手，探讨芪桂益脉灵对缺血再灌注损伤P38通路和ERK1/2通路的影响。本实验研究显示，芪桂益脉灵不增加P38和ERK1/2的总表达，而是通过降低P38磷酸化水平，提高ERK1/2磷酸化水平抑制细胞凋亡，减轻炎症反应。由此表明，芪桂益脉灵具有很好的改善急性心肌缺血再灌注损伤，减轻心肌的坏死灶，改善心肌的病理学改变，保护损伤心肌。

芪桂益脉灵本方由黄芪、桂枝、三七、党参、麦冬、五味子等药物组成，方中黄芪补气诸药之最，可补全身之气，桂枝温通经脉，二药相互配伍，为补气通脉的主药；党参助黄芪增强补气行气作用；三七活血化瘀，养血行血通脉。诸药相互配伍，实现益气活血化瘀通脉之功效。此外，现在药理研究发现，黄芪能清除自由基，促进血清蛋白质的更新，促进机体代谢，扩张冠脉血管和外周血管，党参、麦冬、五味子能增加冠脉血流量，降低心肌耗氧，改善微循环。芪桂益脉灵能够下调缺心肌组织P-P38蛋白表达，升高P-ERK1/2蛋白表达，抑制细胞凋亡，具有抗心肌缺血损伤的作用。

［1］ 金世云，何淑芳，吴昊，等.MAPK通路在瑞芬太尼预处理减轻心衰大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤中的作用［J］.中国药理学通报，2014，11：1590～1595.

［2］ 郑晓丹，严世芸，秦仲君.通心脉方对大鼠心肌缺血再灌注损伤AKt及p38αMAPK蛋白表达的影响［J］.中医研究，2011，6：14～17.

［3］ 武敏.ERK1/2在不同年龄大鼠离体心脏缺血后适应中的保护作用［D］.河北医科大学，2014.

［4］ 王峰，李建生，高剑峰.川芎嗪、参附注射液及联合应用预处理对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌的保护作用［J］.中国实验方剂学杂志，2015，16：147～151.

［5］ 蔡丽.大鼠脑缺血再灌注损伤Cathepsin D介导的细胞凋亡与ERK1/2信号通路的关系［D］.南华大学，2014.

［6］ 田明慧.厄贝沙坦对大鼠心肌缺血再灌注细胞凋亡与ERK1/2通路的影响［D］.辽宁医学院，2012.

［7］ 李焰，刘凤丽，田艳霞，等.依达拉奉对脑缺血再灌注损伤后p-ERK1/2表达的影响［J］.天津医药，2010，4：310～312，355.

黑龙江省自然科学基金，（编号：H201326）

赵 龙

1006-6233（2016）08-1302-04

A 【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2016.08.027