氯沙坦对华法林诱导的大鼠血管钙化的作用研究

邵娟　李敏才　吴基良

437100 咸宁，湖北科技学院糖尿病及心脑血管病重点实验室



·基础研究·

氯沙坦对华法林诱导的大鼠血管钙化的作用研究

邵娟李敏才吴基良

437100 咸宁，湖北科技学院糖尿病及心脑血管病重点实验室

目的观察氯沙坦对华法林诱导的大鼠血管钙化模型的影响，并探讨其可能的作用机制。方法28只5周龄雄性SD大鼠按随机数字表法分为4组：对照组(C)、模型组(M)、模型+低剂量氯沙坦组(M+L)、模型+高剂量氯沙坦组(M+H)(每组7只)。造模成功后取各组大鼠主动脉进行HE染色和茜素红染色，观察血管壁形态学变化和钙盐沉积情况。实时荧光定量PCR检测缝隙连接蛋白(Cx43)mRNA表达，Western blot检测丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、Cx43和基质Gla蛋白(MGP)表达情况。结果华法林能够诱导大鼠血管钙化模型。与对照组比较，模型组Cx43 mRNA和蛋白表达显著上调(3.98±0.65比1.06±0.31，P<0.01；1.91±0.45比1.03±0.07，P=0.029)，MAPK家族中细胞外信号调节激酶(ERK)活性显著增加(1.40±0.19比1.04±0.04，P=0.032)，MGP表达显著下降(0.19±0.07比1.00±0.02，P<0.01)。与模型组比较，两种剂量氯沙坦干预组Cx43 mRNA和蛋白表达均显著下调(2.28±0.47比3.98±0.65，P=0.021；1.07±0.24和0.64±0.24比1.91±0.45，P=0.047和0.013)，ERK活性显著降低(0.76±0.04和0.69±0.09比1.40±0.19，均为P<0.01)，MGP表达显著增加(0.45±0.08和0.83±0.10比0.19±0.07，P=0.013和P<0.01)。结论氯沙坦可以抑制华法林诱导的大鼠血管钙化，可能与下调Cx43表达及ERK活性，增加MGP表达有关。

氯沙坦；血管钙化；缝隙连接蛋白43；细胞外信号调节MAP激酶类；基质Gla蛋白

Fund program：National Science Foundation of China (No.81270355); National Science Foundation of Hubei Province (No.2014CFB211)

血管钙化是许多心血管疾病普遍存在的病理改变，是心脑血管事件发生率和死亡率显著增加的重要危险因素[1]。既往认为血管钙化是一个被动的钙磷沉积于血管壁的过程，近年来研究表明血管钙化是一个与骨发育类似的、主动的可调控的生物学过程[2]。其中血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)向成骨细胞表型转化是血管钙化的中心环节[3]。多条信号通路及细胞因子共同参与了该病理过程，但具体的调控机制尚不清楚。

氯沙坦是一种血管紧张素Ⅱ的1型受体(AT1R)阻断剂，能阻断肾素-血管紧张素系统激活，从而发挥一系列生理效应。已有研究表明，阻断肾素-血管紧张素系统能够降低动脉粥样硬化、糖尿病、慢性肾病等疾病的发病率和死亡率[4-5]。有报道称，氯沙坦可以抑制高脂饲料诱导的新西兰兔动脉粥样硬化及血管钙化[6]。本研究旨在华法林诱导的大鼠血管钙化模型基础上，观察氯沙坦对血管钙化的影响，并探讨可能的作用机制。

1　材料与方法

1.1实验动物

5周龄雄性SD大鼠28只，80～100 g(清洁级)，购自武汉大学实验动物中心(合格证号：NO.42000500004280)。

1.2主要试剂

华法林和氯沙坦购自Maya试剂公司，茜素红购自Sigma，抗Cx43抗体购自Abcam公司，抗MGP抗体购自Santa Cruz公司。抗MAPK抗体及抗GAPDH抗体购自Cell Signaling Technology公司。Trizol试剂(北京艾德莱生物)，逆转录试剂盒(GeneCopoeia，USA)，SYBR Premix Ex TaqTM(Takara，Japan)，PCR扩增引物由擎科生物公司合成。普通PCR仪(Bio-Rad，USA)，752紫外分光光度计(上海舜宇恒科学仪器有限公司)，7900荧光定量PCR仪(ABI，USA)。

1.3大鼠血管钙化模型建立及实验分组

参照文献[7]建立大鼠血管钙化模型，28只5周龄雄性SD大鼠适应性喂养1周后，按随机数字表法分为4组，每组各7只：对照组(C组)、模型组(M组)、模型+低剂量氯沙坦组(M+L组)、模型+高剂量氯沙坦组(M+H组)。C组：普通饲料喂养，给予和模型组等容量生理盐水皮下注射；M组：每天早上8点给予华法林(15 mg/100 g)和维生素K1(1.5 mg/100 g)皮下注射1次，晚上8点第2次给予华法林(15 mg/100 g)皮下注射，持续2周；M+L组：在模型组基础上于第2周每天早上9点给予氯沙坦(1 mg/100 g)皮下注射持续1周；M+H组：在模型组基础上于第2周每天早上9点给予氯沙坦(2 mg/100 g)皮下注射持续1周。在第1次给予华法林皮下注射前24 h及48 h，所有大鼠分别给予维生素K1(1.5 mg/100 g)皮下注射1次预防出血。待造模完成后处死大鼠取主动脉，收集标本于-80℃冰箱保存或甲醛固定。

1.4HE染色

取大鼠主动脉血管，4%中性甲醛固定，石蜡包埋连续切片，常规脱蜡、脱水后行苏木素-伊红染色(HE染色)，于显微镜下观察拍照。

1.5茜素红染色

取大鼠主动脉血管，4%中性甲醛固定，石蜡包埋连续切片，常规脱蜡至水，用1%茜素红染色10 min，常规脱水透明，中性树胶封片，显微镜观察其形态特征。

1.6实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测

按Trizol试剂盒说明书提取组织总RNA，采用752紫外分光光度计对RNA浓度进行测定。根据逆转录试剂盒说明，逆转录合成cDNA。再根据SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒说明，以合成的cDNA为模板进行qRT-PCR反应。Cx43引物序列：Cx43上游引物为5′-TGCTCCTCACCAACGGCTCCACT-3′，下游5′-GCGCTGTAGTTCGCCCAGTTTT-3′； 以GAPDH为内参，GAPDH上游引物5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′。逆转录条件：94℃ 4 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 25 s，30个循环；72℃ 4 min，4℃ 4 min。qRT-PCR反应条件：50℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，40个循环。实验重复3次，根据2-△△Ct法计算相对表达量并进行统计。

(2)第二阶段。经过专业组织的基本技能比赛、专业技能比赛和指导教师的筛选，挑选优秀学生进入电信学院科技创新中心、名师工作室、技能竞赛等团队，学院提供专门的场地并划拨专项经费进行扶持，由专业骨干教师指导团队学生、带领他们参加国家、省、市级技能竞赛或完成企业合作项目开发，其他学生则准备专业技能考证。

1.7Western blot检测

将主动脉从-80℃冰箱中取出置于冰上匀浆提取总蛋白，用BCA法进行蛋白定量。样品通过8%SDS-PAGE电泳分离，并转移到PVDF膜上；经5%脱脂奶粉室温封闭1 h后，加一抗(Cx43 1∶8 000、GAPDH 1∶1 000，MAPK 1∶1 000，MGP 1∶300)稀释液，4℃孵育过夜；经洗涤后，用HRP标记的二抗稀释液(1∶5 000)室温孵育1 h，以ECL发光试剂盒显影；图像分析软件扫描条带灰度值，计算蛋白表达相对定量，实验重复3次。

1.8统计学方法

2　结果

2.1氯沙坦对华法林和维生素K1诱导的血管钙化的影响

HE染色的形态学特征：VSMCs排列紊乱，血管壁结构松散、厚度增加、弹性降低，部分管壁中层断裂，这些都是血管钙化的典型病变。经钙化特异性染色——茜素红染色后，模型组中部分血管区域呈现深红色条纹样钙盐沉积特征。表明华法林和维生素K1联合应用能够诱发血管钙化。经过氯沙坦处理后发现血管壁结构形态和钙盐沉积情况均明显减轻(图1、2)。

2.2氯沙坦对主动脉Cx43 mRNA及蛋白表达的影响

缝隙连接是存在于相邻细胞间的膜通道结构，基本组成单位是连接蛋白(connexin，Cx)，在VSMCs及成骨细胞中存在着丰富的缝隙连接，主要表达Cx43。有研究发现，Cx43能调控成骨样细胞分化及骨形成过程[8-9]。在本实验中，qRT-PCR结果表明，与对照组比较，模型组Cx43 mRNA表达水平显著性增高；两种剂量氯沙坦干预组Cx43 mRNA表达水平较模型组均不同程度降低，且高剂量氯沙坦处理组降低更明显(图3)。Western blot结果显示，与对照组比较，模型组Cx43蛋白表达水平显著增高；两种剂量氯沙坦处理组Cx43蛋白表达水平较模型组均显著降低，且高剂量组降低更显著(图4)。

A：对照组；B：模型组；C：模型+低剂量氯沙坦组；D：模型+高剂量氯沙坦组图1　大鼠主动脉HE染色(×100)

A：对照组；B：模型组；C：模型+低剂量氯沙坦组；D：模型+高剂量氯沙坦组图2　大鼠主动脉茜素红染色(×100)

与对照组比较，aP<0.01 ；与模型组比较，bp<0.05 图3　qRT-PCR检测主动脉Cx43 mRNA表达(n=7)

与对照组比较，aP<0.01 ；与模型组比较，bP<0.05 图4　Western blot 检测主动脉Cx43蛋白表达(n=7)

2.3氯沙坦对主动脉MAPK蛋白表达的影响

MAPK是一类细胞信号调节激酶，MAPK信号途径对调控细胞增殖及分化起关键作用，也是血管钙化过程中一条重要的信号通路。Western blot结果显示，与对照组比较，模型组主动脉MAPK中的ERK信号磷酸化被激活，但未检测到c-jun氨基末端激酶(JNK)及丝裂原活化蛋白激酶(P38)信号活化。两种剂量氯沙坦干预组均能显著降低ERK磷酸化水平，且高剂量组降低更明显(图5)。

与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.01图5　Western blot 检测主动脉MAPK蛋白表达(n=7)

2.4氯沙坦对主动脉MGP表达的影响

MGP是体内最重要的钙化抑制物，MGP能够与矿化物、钙离子等结合抑制矿化物和钙结晶的生长。MGP表达的减少常预示着VSMCs表型向成骨样细胞表型的转换，更易发生血管钙化。在本实验中，与对照组相比，模型组MGP的表达明显下降；与模型组相比，两种剂量氯沙坦干预组均能显著增加MGP的表达，且具有一定剂量依从性(图6)，提示氯沙坦有可能通过上调MGP的表达抑制大鼠血管钙化的发生。

与对照组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.05，cP<0.01图6　Western blot检测主动脉MGP表达(n=7)

3　讨论

血管钙化常涉及动脉内弹力膜及中层弹性纤维钙化，引起动脉变硬及管腔压力增加。常见于动脉粥样硬化、糖尿病和慢性肾病等疾病，与心血管疾病高发病率及死亡率密切相关[10]。近年来，许多研究表明血管钙化是一个类似于骨形成的主动调节过程，VSMCs发生成骨样细胞分化在其中起关键作用。华法林是维生素K的抑制剂，基质Gla蛋白(matrix gla protein，MGP)是一种血管钙化抑制因子，其活化需要通过以维生素K为辅因子的羧化作用。华法林通过拮抗维生素K而抑制MGP活化发挥其致动脉钙化作用。我们使用华法林诱导大鼠主动脉血管钙化，经钙化特异性茜素红染色表现为内弹力膜增厚，钙盐沉积和中层弹性纤维钙化等形态学改变。经氯沙坦处理后能明显减轻血管钙化情况。

在心血管系统中，心肌细胞及VSMCs间存在着丰富的缝隙连接，主要表达Cx43。Cx43也是成骨细胞中的主要连接蛋白，是细胞骨化的重要标记物。有研究表明，在机械应激引起的后纵韧带骨化症(OPLL)患者韧带组织中，Cx43表达上调，从而促进了韧带细胞的成骨样分化[8]。我们的研究发现，在血管钙化模型组中Cx43 mRNA及蛋白表达明显上调，与前述研究一致，经氯沙坦干预后Cx43表达均显著下调。

MAPK是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，包括ERK、JNK和P38。研究证实MAPK信号途径能将细胞外刺激信号转导至细胞及核内，在细胞增殖、分化及凋亡过程中具有至关重要的作用。许多研究表明，ERK参与了调控VSMCs的成骨样分化过程，但这一过程尚存在争议。Ding等[11]研究表明，纤维连接蛋白能通过ERK信号途径促进VSMCs的成骨样分化。Wu等[12]研究表明，过表达Rap1A能增强ERK/P38磷酸化从而促进C2C12成骨样分化。而Liu等[13]研究证实，硒通过抑制氧化应激及ERK激活抑制H2O2诱导的VSMCs钙化。Liang等[14]研究证实，胃饥饿素能通过ERK信号途径抑制VSMCs的成骨分化，且这种抑制作用具有时间和剂量依赖性。我们的研究表明，氯沙坦在抑制血管钙化过程中抑制了ERK磷酸化水平，但未检测到JNK及P38信号活化。

MGP是由平滑肌细胞及软骨细胞合成的一种细胞外基质蛋白，含有5个γ-羧谷氨酸(Gla)残基，经过以维生素K为辅因子的羧化酶羧化后与羟基磷灰石晶体具有高度亲和力，可显著抑制钙盐沉积及羟基磷灰石晶体，是一种强有力的抑制血管钙化的因子。我们的研究表明，氯沙坦可以明显上调MGP的表达，且具有一定的剂量依从性。提示我们氯沙坦可能通过上调MGP的表达抑制大鼠血管钙化的发生。

综上所述，本研究发现氯沙坦在华法林诱导的血管钙化过程中起抑制作用，这种作用可能是通过氯沙坦下调Cx43的表达及ERK活性，上调钙化抑制因子MGP的表达，从而抑制VSMCs成骨样分化来实现的，为血管钙化的临床防治提供了一个新思路。但本研究尚未涉及Cx43、ERK及MGP在氯沙坦抑制血管钙化过程中的上下游关系。

利益冲突：无

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(本文编辑：谭潇)

Effects of losartan on warfarin-induced vascular calcification in rats

ShaoJuan，LiMincai，WuJiliang

KeyLaboratoryonCardiovascular，CerebrovascularandMetabolicDiseaseofHubeiProvince，HubeiUniversityofScienceandTechnology，Xianning437100，ChinaCorrespondingauthor：LiMincai，Email：mincaili@163.com；WuJiliang，Email：xywjl@163.com

ObjectiveTo investigate the effects and mechanism of losartan regulating vascular calcification in rat vascular calcification models induced by warfarin.MethodsTwenty eight 5-week-old male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into 4 groups：Control (C)，Model (M)，Model+Low losartan (M+L)，Model+High losartan (M+H).Vascular calcification was confirmed by HE and Alizarin Red staining to observe morphology and calcium deposition of vascular wall.The expression of Connexin43 (Cx43) mRNA was detected by real-time quantitative PCR.The expression of mitogen-activated protein kinase (MAPK)，Cx43 and Matrix Gla Protein (MGP) were analyzed by western blot.ResultsThe vascular calcification could be induced by warfarin in rats.Compared with C group，The expressions of Cx43 mRNA and protein in aorta in model group were up-regulated significantly (3.98±0.65vs.1.06±0.31，P<0.01；1.91±0.45vs.1.03±0.07，P=0.029).Meanwhile，the extracellular signal-regulated kinase (ERK) activity was significantly increased (1.40±0.19vs.1.04±0.04，P=0.032) and the expression of MGP was significantly decreased (0.19±0.07vs.1.00±0.02，P<0.01).Compared with M group，the expression of Cx43 mRNA and protein of aorta in M+L and M+H group were down-regulated significantly (2.28±0.47vs.3.98±0.65，P=0.021；1.07±0.24 and 0.64±0.24vs.1.91±0.45，P=0.047 and 0.013) and ERK activity was significantly decreased (0.76±0.04 and 0.69±0.09vs.1.40±0.19，bothP<0.01).Meanwhile，the expression of MGP was significantly increased (0.45±0.08 and 0.83±0.10vs.0.19±0.07，P=0.013 andP<0.01).ConclusionsWarfarin-induced vascular calcification in rats could be suppressed by losartan.The mechanism may be related with inhibition of Cx43 expression and ERK activation，and increased MGP expression.

Losartan；Vascular calcification；Connexin 43；Extracellular signal-regulated MAP kinases；Matrix gla protein

李敏才，电子信箱：mincaili@163.com；吴基良，电子信箱：xywjl@163.com

10.3969/j.issn.1007-5410.2016.04.010

国家自然科学基金项目(81270355)；湖北省自然科学基金项目(2014CFB211)

2016- 03-07)