蚧菌共寄生对马尾松针叶POD活性的影响

蔡晓明，陈家荣，梁光红

(1.福建农林大学林学院，福建 福州 350002； 2.福州市林业局，福建 福州 350005；3.建瓯市叶坑国有林业采育场，福建 建瓯 353133)

蚧菌共寄生对马尾松针叶POD活性的影响

蔡晓明1，2，陈家荣3，梁光红1

(1.福建农林大学林学院，福建 福州 350002； 2.福州市林业局，福建 福州 350005；3.建瓯市叶坑国有林业采育场，福建 建瓯 353133)

松突圆蚧与枯斑拟盘多毛孢菌都是严重危害福建省马尾松的主要林业有害生物。由于二者可共寄生于马尾松的松针，因此重点研究测定松针在二者共寄生条件下体内过氧化物酶的活性变化，对于探析松突圆蚧-枯斑拟盘多毛孢菌-马尾松针叶之间的互作关系具有重要作用。以5年生马尾松有虫有病(共寄生)、有虫无病(独寄生/虫)、无虫有病(独寄生/病)、无虫无病(健康针叶，对照)针叶为研究对象，采用紫外吸收法测定松针内过氧化物酶的活性特征。结果表明，不同松针的POD酶活性大小顺序为：有虫有病>有虫无病>无虫有病>无虫无病。显然，病、虫无论是共寄生还是独寄生都会诱导POD活性上升；但有虫有病、有虫无病处理的POD活性分别是无虫有病处理的POD活性的5.10、3.72倍，表明虫害在POD活性诱导过程中占据了主导作用；共寄生处理的POD实际测定值为435.0 U·g-1·min-1，显著高于二者单独处理条件下POD的理论相加值402.8 U·g-1·min-1(P<0.05)，表明松突圆蚧、枯斑拟盘多毛孢菌在诱导POD活性上升过程中可能存在互惠共利关系并导致了联合增效作用。因此，防治松突圆蚧时建议兼治松赤枯病，可进一步提升防控效果。

松突圆蚧；枯斑拟盘多毛孢；马尾松；共寄生；过氧化物酶

松突圆蚧(HemiberlesiapitysophilaTakagi)属同翅目(Homoptera)盾蚧科(Diaspididae)，是一种危险性极大的林业外来入侵害虫，危害性极强。我国20世纪80年代初由珠海入侵，成为我国南部地区最具代表性的森林外来入侵物种之一。10 a间便快速扩张至广东大部分地区，福建和广西局部地区，在沿海地区危害猖獗[1-2]，并呈现向内陆林区扩展蔓延的态势，对福建省森林资源及国土生态安全构成了严重的威胁[3-5]。松突圆蚧在福建没有明显的越冬现象，主要聚居在松针鞘内通过刺吸松针进行危害，受害针叶出现黄化、死亡和早落，甚至导致松树大面积枯死或衰退。而枯斑拟盘多毛孢(Pestalotiasfunereal)属于半知菌亚门，黑粉菌目，是松赤枯病的病原真菌，被列入2003年国家林业局首次发布的林业危险性有害生物名单(检防函[2003]14号)。该病原菌能浸染多种松属植物，是中国长江以南森林内广泛存在的优势菌种。主要通过伤口、自然孔口侵入，常寄生在松针叶鞘，引起针叶萎黄病、死亡、早落等[5-6]。

2012年6月，通过野外调查发现，松突圆蚧与枯斑拟盘多毛孢在同一松针的共寄生比例最高达43%，特别在6—10月松突圆蚧种群密度较低的季节[4-5]，二者共寄生针叶松突圆蚧的存活虫口数量显著增多；它们还具有重叠的危害高峰期且主要借助风力传播。因此，推测共寄生的松突圆蚧和枯斑拟盘多毛孢可能有互相促进的作用，从而对植株产生更大的危害[6]，为此开展了系列生理生化试验。本文以邻甲氧基苯酚(即愈创木酚)为过氧化物酶的底物，采用紫外吸收法测定过氧化物酶的活性，探讨松突圆蚧与枯斑拟盘多毛孢共寄生条件下的互作关系及二者的成灾机制，探索治理松突圆蚧新的辅助方法，具有一定的理论与实践意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采用接虫法制备感虫样株。2013年3月中旬—4月中旬，从野外采集松突圆蚧危害的松枝(若虫高峰期)，剪取严重受害的小枝挂放于5年生健康松苗上，定期检查其若虫固定及蚧壳形成，以此获得感虫条件基本一致的受害松苗。同时，采用喷雾法制备感病样株。先采用PDA平板培养基培养菌丝，采用打孔器取直径7 mm菌丝块接种到100 mL的PD培养基(马铃薯和葡萄糖)培养，然后在25 ℃下静置培养27 d，用双层纱布滤去菌丝体，再用双层滤纸过滤获得液体代谢物备用。接种时将液体代谢物均匀喷雾到5年生健康松苗上，定期检查松针的感病情况，以此获得感病植株与样品。

按照上述方法，10束待测松针分别来自：①有虫有病(共寄生)，将携有大量初孵若蚧的松枝挂放在5年生健康松苗上，5 d后采用喷雾法接入枯斑拟盘多毛孢菌，待松针出现初期症状后，选择并标记有虫有病的松针作为试验材料；②有虫无病(独寄生/虫)，按上述方法只接入松突圆蚧若蚧；③无虫有病(独寄生/病)，按上述方法只接入枯斑拟盘多毛孢菌；④健康松针，作为对照。同时，确保在同一时段和相同气象条件下取样。

1.2 粗酶液的制备

称取待测松针样品0.1 g，剪碎放入研钵中，分多次向研钵中加入适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。残渣再用5 mL磷酸缓冲液提取1次，匀浆分装倒入离心管。以4000 r·min-1低温离心15 min，上清液即为粗酶液，用磷酸缓冲液定容至10 mL，收集上清液于4 ℃冰箱备用。

1.3 过氧化物酶活性测定

过氧化物酶活性测定采用紫外分光法[7-12]。

1.3.1 反应时间的优化 随机抽取采集到的试验针叶样品0.1 g。取A、B 2支试管，随机抽取粗酶液，按照表1配制反应溶液。迅速将2支试管中的溶液混合均匀后倒入比色杯，置于分光光度计样品室内，立即开启秒表记录时间，于470 nm波长处测定吸光度值，每隔10 s读数1次。一直读取至250 s，并记录数据。依据吸光值随反应时间的变化曲线即底物的反应进度来确定反应时间。

表1 预备试验试剂添加量

1.3.2 过氧化物酶活性 测定时取A、B 2支试管，按照表1配制反应溶液。然后将2支试管中的溶液混合均匀后倒入比色杯，置于分光光度计并在470 nm波长处测定吸光度值，每隔10 s读数1次记录数据直至2 min。每处理重复3次。

本试验以邻甲氧基苯酚(即愈创木酚)为过氧化物酶的底物，在该酶作用下，H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚在470 nm波长处有最大光吸收，依据吸光度变化斜率即可确定过氧化物酶活性。

1.4 统计方法

各吸光值由3次重复样品计算而得，采用Office Excel 2007进行数据标准变换和初步分析。计算公式参照研究文献[9]。

2 结果与分析

2.1 反应时间的优化

从图1可以看出，吸光度值在0～2 min内呈先小幅上升后缓慢下降，最终趋于一个临界值。推测这一吸光值呈现大幅下降趋势现象与底物反应殆尽有关，反应宜在前2 min内完成效果最好，因此后续测定的反应时间为2 min。

2.2 POD活性水平

从测定的POD活性水平看，所有处理组POD活性都明显高于对照(图2)，表明病、虫无论是共寄生还是独寄生都会诱导POD活性上升。但3种处理POD活性比较发现，共寄生的POD活性比松突圆蚧独寄生略高，仅为其POD活性的1.37倍；共寄生POD活性却是枯斑拟盘多毛孢菌独寄生POD活性的5.10倍，相差349.7个酶活性单位；在各自独寄生处理后，松突圆蚧独寄生的POD活性水平是枯斑拟盘多毛孢菌独寄生的POD活性的3.72倍，二者相差232个酶活性单位。表明松突圆蚧危害在诱导POD活性过程中具主导作用，而枯斑拟盘多毛孢菌的诱导作用相对较弱。

二者共寄生的POD实测值435.0 U·g-1·min-1；但若将独寄生虫、独寄生病的POD活性进行简单相加，得到POD活性的理论值为402.8 U·g-1·min-1，低于实测值。表明松突圆蚧、枯斑拟盘多毛孢菌在诱导POD活性上升过程中存在联合增效作用或互惠共利效应。

2.3 POD活性的变化过程与趋势

从反应过程来看，各处理的吸光值—时间的线性拟合斜率代表POD活性水平(图3)。共寄生所诱导的吸光值明显高于其他处理，且变化斜率最大(K=-0.0803)，反应最为敏感；然后依次是有虫无病(K=-0.0443)、无虫有病(K=-0.0183)；无虫无病(K=0.0018)的变化最为平缓，趋势最小，表明不存在明显的活性变化。比较数据趋势及线性模拟的相关系数，有虫有病(R2=0.8969，P<0.05)的数据波动最大，因而线性相关系数最小；无虫有病(R2=0.9731，P<0.05)相关系数最高；有虫无病(R2=0.9314，P<0.05)与无虫无病(R2=0.9486，P<0.05)的相关系数较为接近。

3 结论与讨论

3.1 病虫共寄生比独寄生具有更高的危害水平

一般地，寄主植物在遭受机械损伤或病虫危害后，都会在形态上在其受伤部位形成愈伤组织，在生理上诱导防御反应等，如改变植物体内营养物质和次生物质的组成[13]；膜系统也会受到破坏并使电导率上升[14]，而体内抗氧化酶系(POD、SOD、CAT、PPO、GSH)等的活性较大幅度增加可缓解逆境胁迫对膜系统的伤害[14-17]，这是植物对外界胁迫应答的典型生理过程。松突圆蚧、枯斑拟盘多毛孢菌无论是单独寄生还是共寄生马尾松的松针，都会诱导其松针内的POD活性增强；但从三者活性变化的程度来看，共寄生所诱导的POD活性呈现了“1+1>2”的特点，即当二者共存条件下，松针内POD活性高于二者各自独寄生条件下的理论总和，表明共寄生比独寄生对松针具有更高的危害水平，可能是二者共同寄生松针诱导植物抗性的叠加效应。

3.2 松突圆蚧在共寄生体系中对POD活性诱导具有主导作用

松突圆蚧与枯斑拟盘多毛孢菌无论是共寄生还是独寄生都会诱导受害针叶POD活性上升，但上升的水平则各不相同。涉及虫害的2种处理的POD活性明显高于病原单独寄生的处理，表明虫害对POD活性诱导具有主导作用，而病害对POD活性诱导作用相对较小。与前人的研究相比，有关单一病害或虫害对植株危害后诱导抗氧化酶系的研究颇多[14-20]，如湿地松经松针褐斑病菌毒素处理后，PAL、PPO与SOD 活性呈现不同规律的变化[14]；毛白杨接种野生根癌农杆菌后，会诱导POD等酶活性提高[12]；棉蚜取食可诱导棉花多酚氧化酶和过氧化物酶的活性增加[17]。但涉及二者共寄生及互作下的抗逆酶系研究较少，无法进行类似研究的比较。至于松突圆蚧在共寄生体系产生主导作用的机制，尚需进一步深入研究。

3.3 松突圆蚧与枯斑拟盘多毛孢菌在共寄生体系中具有互利关系

本研究表明，松突圆蚧与枯斑拟盘多毛孢菌在诱导POD活性上升过程中存在联合增效作用或互惠共利效应；野外调查还发现，枯斑拟盘多毛孢菌一般在新的松针抽生不久先行侵入叶鞘外部，而松突圆蚧待新抽生松针叶鞘松散后才大量侵入叶鞘内部，可能与新抽松针叶鞘包裹紧密而不易侵入内部有关。为此推测二者互利模式可能为：枯斑拟盘多毛孢菌侵入松针导致直接危害，还突破了松针的物理防御，为松突圆蚧侵入创造了便利条件；松突圆蚧侵入后具有更高的危害水平，进一步突破松树的防御体系并减弱松树长势，随后更有利于二者继续危害松针并加剧危害程度。但有关其互利的分子机制还有待继续研究。因此，在防治松突圆蚧过程中，应考虑兼治松赤枯病，不但利于控制病害的蔓延危害，而且能减少松突圆蚧的侵入叶鞘内的机率和降低危害程度，达到进一步提高松突圆蚧的防控效果。

当然，要揭示松突圆蚧与枯斑拟盘多毛孢菌在共寄生条件下互作的生理生化机制，还需要对松针的形态结构变化、植物营养物质及次生物质含量等进行测定[13]，抗逆酶的全面分析以及基因水平上的表达、松树抗性和环境因子等方面开展更系统而深入的研究。

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Effect of Co-Parasitism byHemiberlesiapitysophilaandPestalotiafunereaon Peroxidase of Masson Pine Needles

CAI Xiao-ming1，2，CHEN Jia-rong3，LIANG Guang-hong1

(1.FujianAgricultureandForestryUniversity，Fuzhou350002，Fujian，China； 2.FuzhouForestryBureauofFujianProvince，Fuzhou350005，Fujian，China； 3.YekengState-ownedForestryFarm，Jianou353133，Fujian，China)

HemiberlesiapitysophilaandPestalotiasfunereaare most important species infested masson pine trees in Fujian Province.Both of them were founded frequently in the same pine needle which means they are likely to exist in the same needle.So we just focused on the Peroxidase of needles infested by both of them，one of them only to explore the relationship among the fungi，pest and host.The peroxidase was extracted from five-year old needle and measured based on ultraviolet absorption method with control of health needles.The results showed that activity order of Peroxidase was co-parasitism，H.pitysophilaonly，P.funereaand control.Peroxidase activity was always induced to increase after the needles were inoculated，no matter how the treatment was.But the treatment concerned withH.pitysophila，including co-parasitism andH.pitysophilaonly，were much higher than treatment ofP.funereaonly，namely，they were 5.10 and 3.72 times asP.funereaonly，which means pest infestation played more important role during the process of co-parasitism.Theoretical value of pest only and fungi only was still lower than that of co-parasitism，which means each of them played a mutually beneficial role which leads to superimposed effect.Therefore，to improve and enhance the control effect ofH.pitysophila，prevention ofP.funereais also needed to be taken into consideration.

Hemiberlesiapitysophila；Pestalotiasfunerea；Pinusmassoniana；co-parasitism；peroxidase

10.13428/j.cnki.fjlk.2016.02.016

2015-08-12；

2015-08-23

福建省自然科学基金(2011J01070)

蔡晓明(1975—)，男，福州永泰人，福州市林业局高级工程师，在职硕士，从事林业有害生物防治检疫与林业科技推广工作。E-mail：457118557@qq.com。

梁光红(1975—)，男，福建农林大学林学院副教授，硕士生导师，从事森林昆虫学研究。E-mail：fjlhg@126.com。

S791.248；S763

A

1002-7351(2016)02-0085-05