基于ITS序列的南岭黄檀分子鉴定

李奇威，杜贵锋，谭贵良，孙 瑾，王业胜，周 林，朱 爽

(1.广东药科大学生命科学与生物制药学院、广东省生物技术候选药物研究重点实验室，广东 广州 510006；2.中山市质量计量监督检测所，广东 中山 528403； 3.华南农业大学林学院，广东 广州 510120)

基于ITS序列的南岭黄檀分子鉴定

李奇威1，杜贵锋1，谭贵良2，孙 瑾3，王业胜1，周 林1，朱 爽1

(1.广东药科大学生命科学与生物制药学院、广东省生物技术候选药物研究重点实验室，广东 广州 510006；2.中山市质量计量监督检测所，广东 中山 528403； 3.华南农业大学林学院，广东 广州 510120)

以南岭黄檀(Dalbergiabalansae)为研究对象，采用改良CTAB法对南岭黄檀边材进行总DNA提取，利用引物对rDNA-ITS序列进行PCR扩增和序列测定，用MEGA软件进行系统发育分析，构建南岭黄檀及其近缘树种的分子系统发育树。结果表明：用改良CTAB法可以成功提取南岭黄檀边材总DNA，并在模板稀释倍数为1×10-2～1×10-3倍时可成功PCR扩增出rDNA-ITS序列，并基于rDNA-ITS序列测定和系统发育树构建的分子生物学方法，利用ITS序列对南岭黄檀进行分子鉴定，为南岭黄檀的种类鉴定和种间的分类地位提供分子生物学根据。

南岭黄檀；DNA提取；ITS序列；分子鉴定

南岭黄檀(DalbergiabalansaePrain.)为豆科黄檀属植物，别名水相思、黄类树，广泛分布于浙江、福建、湖南、广东、广西、四川、贵州等地。南岭黄檀冠幅大、叶量多，在中国南部城市常被用作蔽荫树或风景树；其枝条生长速度快、产量高[1]，也是云南紫胶虫生长发育和繁殖的优良寄主植物[2]，3年生南岭黄檀平均每棵树每年可产紫胶10 kg，为种植户带来可观的经济收益[3]。

由于南岭黄檀与黄檀属内的红木木材容易混淆，而南岭黄檀的鉴定是依靠传统的形态学方法来实现，这要求鉴定员对木材的结构特征十分熟悉，经验要丰富，且有时难以准确识别至种的水平，从一定程度上给南岭黄檀的鉴别带来困难。随着分子生物学的发展，DNA分子遗传学技术逐渐被广泛应用于植物、动物、细菌等物种鉴定[4]。其中DNA条形码技术因具有条形码片段短、易于提取、变异区两端序列高度保守等特点[5]，可利用它进行准确的物种鉴定，弥补了传统鉴定方法的不足，因此逐渐成为一种热门的物种鉴定工具。Kress等[6]对被子植物类群进行取样和研究，提出利用ITS和trnH-psbA的组合进行植物类群鉴定是较好的选择。朱爽等[7]成功利用ITS序列对毛钩藤与无柄钩藤进行分子鉴定。然而目前尚未见关于南岭黄檀木材DNA的提取及其近缘种属的分子系统发育分析报道，本试验通过改良CTAB法提取南岭黄檀木材DNA，用特异引物对ITS区进行PCR扩增，并进行克隆测序，所得序列与GenBank数据库已登记的近缘树种ITS序列构建较完整的红木树种及其近缘种属之间的系统发育树，并探讨其亲缘关系，从而为南岭黄檀和红木木材及其近缘种属的分子鉴定分析提供分子生物学理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与来源

试验材料由广东省中山市质量计量监督检测所提供，取材地为广州华南植物园，采取的新鲜样品立即于-20 ℃保存。华南农业大学林学院孙瑾教授通过组织切片分析等方法初步鉴定样品为南岭黄檀。试验前用手术刀取其边材部位并切成小块状，90%乙醇浸泡10 min，干燥后进行DNA提取。

1.2 试剂

电泳染料使用EB替代品SYBR Green I(北京百泰克生物技术有限公司)，DL2000 DNA Marker(TIANGEN生化科技有限公司)，DNA凝胶回收试剂盒(上海碧云天Beyotime公司)，rTaq酶、pMD18-T-Vecter载体、EscherichiacoliJM109感受态细胞(大连宝生物工程有限公司TaKaRa)，琼脂糖(西班牙BIOWEST)，氨苄青霉素(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)，其余试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 改良CTAB法提取总DNA 称取南岭黄檀木材样品1 g，置预冷的研钵中，加液氮研磨成粉末。将粉末移至50 mL离心管，加65 ℃预热的CTAB裂解液5 mL[7]，充分混匀；65 ℃水浴2 h，12000 r·min-1离心10 min，取上清液，用等体积的Tris饱和酚、酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)和氯仿-异戊醇(24∶1)各抽提1次，12000 r·min-1离心10 min，取上清液，先加入2倍体积的无水乙醇，再加入3 mol·L-1NaAc，使溶液中NaAc最终质量浓度为0.3 mol·L-1，-20 ℃沉淀2 h，12000 r·min-1离心10 min，弃上清，用1 mL 70%冷的乙醇洗涤2～3次，干燥后用无菌1×TE缓冲液20 μL溶解，-20 ℃保存备用。

1.3.2 ITS序列PCR扩增 应用植物rDNA-ITS序列的通用扩增引物(上海生工生物工程公司合成)[8-9]ITS4(5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′)和ITS5(5′GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3′)对南岭黄檀总DNA进行rDNA-ITS序列扩增。PCR采用20 μL反应体系：10×PCR Buffer 2.0 μL，dNTP Mix(2.5 mM)0.8 μL，上下游引物各0.4 μL，rTaq酶(5 U·μL-1)0.1 μL，其余体积以无菌超纯水补足。扩增参数见文献[7]。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，使用SYBR Green I染色，120V电泳30 min，最后用Tannon-4100全自动数码凝胶图像分析系统(上海天能科技有限公司)观察、拍照。

1.3.3 PCR产物纯化、连接和转化 PCR扩增产物采用DNA 凝胶回收试剂盒进行回收与纯化。纯化产物连接到pMD18-T-Vecter载体，连接产物转化到E.coliJM109感受态细胞，进行氨苄青霉素选择和蓝白斑的筛选[7]。

1.3.4 序列测定 随机挑取3个单克隆菌落在液体LB培养基培养过夜后，将菌液送至华大基因科技股份有限公司进行测序。测序得到的序列去除引物端后，通过与GenBank中已有的豆科植物ITS区序列进行比对，得到与测序序列相似的ITS序列。

1.3.5 序列分析与系统发育树的构建 根据测序得到的南岭黄檀rDNA-ITS序列在GenBank数据库中比对的结果，确定19个黄檀属物种、5个紫檀属物种和2个决明属物种的ITS序列，将其与本试验所得序列一起导入MEGA(Version 6.06)软件进行多重比对(Clustal W功能)，空位处作缺失状态。比对后的序列用最大简约法(Maximum Parsimony)构建系统进化树，使用自举检验法(boot-strap text)做1000次可信度分析。

2 结果与讨论

2.1 DNA提取结果

本试验所用的CTAB中含有2% PVP，PVP可络合酚，减少酚对DNA的降解。取1×TE溶解的南岭黄檀总DNA样品3 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统记录结果见图1。由图1可以看出，总DNA样品主带清晰，有小于2000 bp的弥散条带，这是由于边材中细胞的DNA有所降解。

2.2 南岭黄檀ITS 序列PCR扩增结果

以提取的总DNA为模板，将模板浓度稀释成1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4倍后进行PCR扩增。扩增结果见图2，由图2可知模板浓度在10-2、10-3倍时条带较亮；而1×10-1倍、1×10-4倍时条带较暗，前者是由于模板溶液中仍有较多PCR抑制物，如残留的酚、多糖等[10]；后者是由于模板浓度太低导致扩增后的产量不高。因此进行南岭黄檀rDNA-ITS序列PCR扩增的较佳模板浓度范围在1×10-2～1×10-3倍，在此模板浓度下，可以减少提取的南岭黄檀总DNA中多糖、酚等抑制物对PCR的不利影响。

2.3 ITS序列分析

将3个单克隆菌液送至广州华大基因公司测序，测序成功率为100%，测序结果在GenBank上进行比对，与数据库中的南岭黄檀ITS序列(AB828612)有99%相似度。试验所得ITS序列与表1中所列的ITS序列用MEGA软件进行比对后，用最大简约法(MP)构建系统发育树(图3)，对自举支持率低于50%的分支进行切断。结果显示，通过对27个物种ITS序列的简约性分析，发育树的枝长为269，一致性指数为0.563319，保留指数为0.723757，所有位点复合指数和简约性信息位点分别为0.454702与0.407706。其中所有黄檀属物种(20个)聚为一支，所有紫檀属物种(5个)聚为一支，决明属物种(2个)聚为一支。在黄檀属中，南美黄檀(D.foliolosa)和巴西黑黄檀(D.nigra)聚为一个小分支，自举支持率为53%；莓叶黄檀(D.arbutifolia)和两粤黄檀(D.benthamii)聚为一小支，支持率为99%。本试验所得序列与南岭黄檀相聚(支持率为94%)后再与紫花黄檀(D.assamica)聚为一小支(支持率分别为94%和96%)。进一步在NCBI上进行比对，样品与南岭黄檀(AB828612)的相似度为98.7%，与紫花黄檀的相似度为96.2%，说明南岭黄檀种内变异少，南岭黄檀与紫花黄檀之间的亲缘关系较近。由于黄檀属、紫檀属分别属于蝶形花亚科、蝶形花科，而决明属则属于苏木亚科，因此在图3的发育树中，黄檀属和紫檀属聚为一支后再与决明属聚类，说明ITS序列可以区分3个近缘属及其属内种间的关系。其中15个物种(黄檀属9个、紫檀属5个、决明属1个)为GB/T 18261—2000红木[11]所规定的红木物种，因此ITS序列也可以为红木木材种类的分子生物学鉴定提供生物学理论依据。

表1 从GenBank 获取ITS 序列物种名称及其编号

表1(续)

3 结论

1)以南岭黄檀边材为试验对象，采用改良CTAB法提取总DNA，可提取出较完整的DNA，并以提取的DNA为模板对rDNA-ITS序列进行多梯度PCR扩增，PCR结果表明模板稀释倍数在1×10-2～1×10-3倍时可扩增出条带清晰的ITS序列。

2)通过对GB/T 18261—2000红木[11]涉及的3个近缘属物种的ITS序列分析，表明ITS序列可以区分近缘属和属内种间的差异，为红木木材种类的分子生物学鉴定提供生物学理论依据。

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[11]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T 18261—2000 红木[S].北京：中国标准出版社，2001.

Molecular Identification ofDalbergiabalansaePrain.Based on ITS Sequence

LI Qiwei1，DU Guifeng1，TAN Guiliang2，SUN Jin3，WANG Yesheng1，ZHOU Lin1，ZHU Shuang1

(1.GuangdongProvinceKeyLaboratoryforBiotechnologyDrugCandidates，SchoolofBiosciencesandBiopharmaceutics，GuangdongPharmaceuticalUniversity，Guangzhou510006，Guangdong，China；2.ZhongshanSupervisionTestingInstituteofQuality&Metrology，Zhongshan528403，Guangdong，China；3.CollegeofForestry，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510120，Guangdong，China)

Total DNA was extracted fromDalbergiabalansaeby modified CTAB method and rDNA-ITS regions were amplified with universally conserved primers.The relationships betweenD.balansaeand its related species were characterized by phylogentic analyses using MEGA by Maximum Parsimony method.The results showed that total DNA could be successfully extracted from sapwood by modified CTAB method and rDNA-ITS region could be amplified successfully when template dilution factor was 1×10-2～1×10-3fold.Based on rDNA-ITS sequence and phylogenetic tree analysis，the molecular identification could be performed onD.balansaeand provide molecular evidence for taxonomy ofD.balansae.

Dalbergiabalansae；DNA extraction；ITS region；molecular identification

10.13428/j.cnki.fjlk.2016.04.018

2016-01-02；

2016-03-02

中山市科技计划项目(2013A3FC0249)

李奇威(1993—)，男，广东广州人，广东药科大学在读硕士研究生，从事分子生物学研究。E-mail：332134284@qq.com。

朱爽，男，广东药科大学副教授，从事分子生物学研究。E-mail：15683727@qq.com。

S792.28；Q75

A

1002-7351(2016)04-0085-04