新型中国被毛孢胞内多糖HSIPS2链构象及抗氧化活性研究

邵双双，贺　亮，韦朝阳，李卫旗，*（.浙江大学生命科学学院，浙江杭州30058；.浙江省林业科学研究院生物技术所，浙江杭州3003）

新型中国被毛孢胞内多糖HSIPS2链构象及抗氧化活性研究

邵双双1，贺亮2，韦朝阳1，李卫旗1，*
（1.浙江大学生命科学学院，浙江杭州310058；2.浙江省林业科学研究院生物技术所，浙江杭州310023）

以发酵得到的中国被毛孢菌丝体为原料进行热水浸提，经过醇沉、脱蛋白、脱色素以及DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱色谱和Sephacryl S-100凝胶柱色谱得到均一性多糖组分（HSIPS2），并对该组分进行链构象及抗氧化活性分析。结果表明：HSIPS2的单糖组成及摩尔比例为葡萄糖∶半乳糖∶甘露糖∶核糖=48.52∶6.58∶5.17∶1.0，其绝对分子量为1.46×104g/mol，纯度为99.82%；该多糖在0.1 mol/L的NaNO3溶液中呈柔顺链构象，流体力学半径Rh=2.3 nm，ML=334.05 nm-1，q=0.70 nm，d=0.69 nm；同时，HSIPS2清除羟自由基的IC50为0.749 mg/mL，氧自由基吸收能力（ORAC值）为872.80 μmol TE/g，说明HSIPS2具有较高的抗氧化能力。

中国被毛孢，多糖，链构象，氧自由基吸收能力

天然虫草自然资源短缺，价格昂贵，人工培养的虫草易于得到，其有效成分及药理活性与天然虫草非常接近。中国被毛孢（Hirsutella sinensis）是从天然虫草中分离得到的虫草菌之一，被确认为冬虫夏草真正的无性型［1-3］。

越来越多的研究表明，多糖是除了蛋白质和核酸之外另一种重要的生命物质，具有多方面、复杂的生物活性及功能［4］。虫草多糖是冬虫夏草的主要活性成分之一，具有很好的药理活性，如抗氧化、调节血糖、免疫调节、抗肿瘤等多方面均有报道［5］，在医药、食品和保健品研发上具有诱人的应用前景。结构决定其生物活性，不同的高级构象表现出不同的生物功能，因此，开展多糖等大分子高级构象的研究具有非常重要的意义。

近年来，有关中国被毛孢多糖的提取分离以及初级结构的研究比较多［6-7］，但是对其胞内多糖分子链构象的研究目前还没有涉及。本实验首次对发酵得到的中国被毛孢胞内多糖进行分子链构象分析，并对其抗氧化活性进行研究，为其多糖类物质的开发利用奠定理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

中国被毛孢菌株（HS001） 由浙江省林业科学研究院提供；葡萄糖（Glc）、岩藻糖（Fuc）、木糖（Xyl）、甘露糖（Man）、半乳糖（Gal）、鼠李糖（Rham）、葡萄糖醛酸（GlcUA）、半乳糖醛酸（GalUA）、阿拉伯糖（Ara）以及核糖（Rib） Sigma公司；无水乙醇、氯仿等试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

CL31R型多功能高速离心机美国Thermo公司；R-210型旋转蒸发仪瑞士BUCHI公司；冷冻干燥机美国LABCONCO公司；U-1900型可见分光光度计日本HITACHI公司；Spectra Max M2多功能酶标仪美国分子仪器公司；AKTA purifier层析系统美国GE医疗集团；戴安U-3000型高效液相色谱仪美国Dionex公司；DAWN-II多角度激光光散射仪美国Wyatt Technology Co；RID-10A示差折光仪日本SHIMADZU公司。

1.2实验方法

1.2.1菌株及其发酵培养［8］孢菌株（HS001）在斜面培养基（马铃薯200 g、葡萄糖20 g、麦麸10 g、蚕蛹粉10 g、琼脂20 g、去离子水1000 mL，自然pH）中4℃保存，然后接种到平板培养基（配方同斜面培养基），18℃条件下培养40 d后，接种到发酵培养基（葡萄糖20 g、蛋白胨5 g、蚕蛹粉10 g、KH2PO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、去离子水1000 mL）26℃振荡培养30 d。

1.2.2多糖的提取及分离纯化参考王蕾等的方法［9］，并做了适当修改。将发酵液经8层纱布过滤，得到的菌丝体再用蒸馏水冲洗3次，冻干。将干燥后的菌丝体粉碎后过60目筛，按料液比为1∶20加去离子水，90℃浸提2 h，8000 r/min离心15 min，收集上清液，滤渣重复提取1次，合并2次提取液。50℃下减压浓缩，冻干得粗多糖。粗多糖溶于水，Sevage法脱蛋白后，采用双氧水法进行脱色素，浓缩，透析（3500 u）。将脱完蛋白色素的多糖样品，过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱（2.0 cm×35 cm），用蒸馏水、0.1、0.3、0.5和0.7 mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱用量依次为28、28、28、28、48 mL流速为1.0 mL/min，每管收集4 mL，采用苯酚-硫酸法检测分布，分别从每管吸取0.2 mL收集液，加入0.8 mL去离子水，1.0 mL 5%的苯酚，再加5 mL浓硫酸，充分振荡，室温反应1 h，490 nm测吸光值。分别收集不同洗脱峰的洗脱液，合并同一洗脱峰的洗脱液，经浓缩、透析、冻干，即可得到几个不同的多糖组分。用Sephacryl S-100凝胶柱色谱（1.6 cm×60 cm）对主峰多糖组分进一步纯化，蒸馏水做洗脱液，流速为0.5 mL/min，每管收集3 mL，分别从每管吸取0.2 mL收集液，加入0.8 mL去离子水，1.0 mL 5%的苯酚，再加5 mL浓硫酸，充分振荡，室温反应1 h，490 nm测吸光值，检测糖分布。可得到纯化后的中国被毛孢胞内多糖HSIPS2。

1.2.3单糖组成单糖成分测定参考Dai等［10］的方法，并做了适当的修改。10种单糖（5 mol/L），分别取150 μL，加入150 μL 0.6 mol/L NaOH溶液，混合均匀后，加入300 μL 0.5 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇液，混匀，70℃水浴100 min，冷却至室温后，加入300 μL 0.3 mol/L HCl中和，然后加入等体积氯仿，充分振荡、离心（4000 r/min，15min），收集水相，重复5次，过0.45 μm膜，待HPLC测定。

取纯化后的多糖3 mg，加入1 mL 4 mol/L三氟乙酸溶液，121℃水解6 h后，加入200 μL甲醇，60℃减压浓缩蒸干，去除残留的三氟乙酸，反复3次，最后加入150 μL去离子水溶解，衍生化方法与上述单糖衍生化制备一致。

RP-HPLC测定条件：检测波长为245 nm，流速为1.0 mL/min，柱温：25℃，柱子：HYPERSIL APS-2 （4.6 mm×250 mm，5 μm，Agilent，USA），进样体积为20 μL，流动相A（乙腈）：流动相B（0.05 mol/L PBS缓冲液，pH6.9）为15∶85。

1.2.4多糖分子量及链构象研究采用静态光散射和动态光散射系统（SEC-MALLS）与在线差动式粘度计（ViscoStarTM II，Wyatt Technology，USA）联用进行测定，可以精确获得多糖的分子量（Mw）、均方根旋转半径（＜S2＞z1/2）、流体力学半径（Rh）和特性粘度（［η］）等构象参数［11］，进而构建模型获知多糖链构象。

配制0.1 mol/L NaNO3溶液（含有0.02%NaN3）作为流动相，过0.22 μm膜，超声脱气30 min。称取3 mg样品溶解于1 mL 0.1 mol/L NaNO3溶液中，磁力搅拌溶解4 h，过0.22 μm膜备用。

参考Rau等［12］的方法，折光率增量dn/dc为0.135 mL/g。进样量为200～300 μL，流速为1.0 mL/min，柱温为室温。采用ASTRA version软件（Wyatt Technology）进行数据收集和计算。

1.2.5抗氧化活性

1.2.5.1羟自由基清除率参考Mao等［13］的测定方法并稍作修改，具体方法为：2.0 mL FeSO4溶液（6 mmol/L）分别与2.0 mL 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的样品混匀，加入2 mL H2O2（6 mmol/L），摇匀，室温静置10 min后，加入2.0 mL水杨酸（6 mmol/L），混匀，室温静置10 min，于510 nm处测定吸光值，VC作为阳性对照，对羟自由基的清除能力按照下面公式进行计算：

其中，A0为空白样品吸光值，As加样后的吸光值，Aj为以蒸馏水代替H2O2的吸光值。

1.2.5.2氧自由基吸收能力（ORAC）使用荧光素作为氧化底物，偶氮二异丁脒盐酸盐（AAPH）为自由基产生剂，并使用Trolox抗氧化剂作为定量样品抗氧化能力的标准。ORAC测定参考Hua等［14］的方法并稍作了修改，在96孔板的微孔中加入20 μL荧光素（35 nmol/L）、40 μL待测样品液和140 μL AAPH （12.8 mmol/L）。该反应在75 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）体系中进行，检测温度为37℃，激发波长为485 nm，发射波长为528 nm，每隔2 min测定一次吸光强度，持续98 min。ORAC实验需要设定两种对照，即没有添加自由基的荧光素的自然衰减对照（-AAPH）和没有抗氧化剂存在时的自由基作用对照（+AAPH）。各个微孔不同时间点的绝对荧光强度与其初始时间的荧光强度之比，得到相对荧光强度，以相对荧光强度采用近似积分法计算荧光衰退曲线下面积（AUC）。Net AUC=AUCsample－AUCblank，AUCblank为没有添加自由基的荧光素的自然衰减，Net AUC与抗氧化物的浓度呈正相关。ORAC值=［AUCsample－AUCblank］（Trolox摩尔浓度/样品摩尔浓度），即Trolox当量（TE），以μmol TE/g表示。

1.3数据分析

采用Microsoft Excel 2010和Origin 9.0软件对相关数据进行统计分析。

2　结果与分析

2.1多糖的提取及分离纯化

由图1可知，多糖脱蛋白脱色素后，经过DEAESepharose Fast Flow色谱柱分离，由0.1 mol/L NaCl溶液洗脱得到组分HSIPS1（17.07%），由0.3 mol/L NaCl溶液洗脱得到组分HSIPS2（82.93%），组分HSIPS1的得率与HSIPS2相比较低，所以收集主要组分HSIPS2 过Sephacryl S-100凝胶柱进一步纯化，得到单一对称的洗脱峰，见图2。

图1　中国被毛孢胞内多糖的DEAE-Sepharose Fast Flow洗脱曲线Fig.1　Elution profile of polysaccharide from Hirsutella Sinensis on DEAE-Sepharose Fast Flow column

图2　HSIPS2的Sephacryl S-100柱层析洗脱曲线Fig.2　Chromatography of HSIPS2 by gel filtration on Sephacryl S-100

2.2HSIPS2的单糖组成

根据10种单糖标准品的液相色谱图（图3）和HSIPS2单糖组成的HPLC色谱图（图4）可知，HSIPS2的单糖组成及摩尔比例为：葡萄糖∶半乳糖∶甘露糖∶核糖=48.52∶6.58∶5.17∶1.0，说明HSIPS2主要由葡萄糖、半乳糖和甘露糖组成，这与刘金花等［15］从中国被毛孢发酵虫草菌丝体得到的HSP-1单糖组成类似（葡萄糖∶半乳糖∶甘露糖=4.522∶1∶1.378），但是检测到HSIPS2中含有核糖（1.63%），目前其他文献还没有报道，说明发酵后得到的HSIPS2是一种新型的多糖。

图3　10种单糖标准品的HPLC色谱图Fig.3　High-performance liquid chromatography of 10 standard monosaccharides

图4　HSIPS2的HPLC色谱图Fig.4　High-performance liquid chromatography of HSIPS2

2.3HSIPS2的分子量及链构象

如图5所示，样品峰出现在12～18 min之间，90°光散射和示差检测器RI所产生的峰形具有相似大小和形状，几乎完全重叠。并且显示多糖呈现单一对称峰，HSIPS2为均一性的纯多糖，而LS信号主峰前的小峰可能是由多糖部分团聚而引起，测得第二维利系数A2=1.0×10-4mol·mL/g2，A2＞0，说明溶剂为良性溶剂［16］。同时，测得HSIPS2多糖纯度达到99.82%。此外，Mw/Mn表示样品的分散度，分子量分布越宽，分散度就越大［17］。仪器检测给出Mw/Mn的值为1.017，比较接近1，表明HSIPS2是一个低分散度的多糖，其分子量Mw= 1.463×104g/mol。均方旋转半径＜S2＞z1/2测得为0.5 nm，由于仪器无法测定＜10 nm的粒子半径，所以给出的＜S2＞z1/2值不准确，需要以该分子的流体力学半径Rh= 2.3 nm来表征。

图5　HSIPS2的SEC-MALLS尺寸排阻色谱图Fig.5　SEC chromatogram of HSIPS2 detected by SEC-MALLS

Mark-Houwink方程（［η］=KMwα）可以表示高分子在溶液中的特性粘度［η］与分子量Mw之间的关系［18］。由图6可知，以lg［η］对lgMw作图得到一条线性关系较好的直线，R2为0.9512，依据直线的斜率和截距求得K=9.67×10-3，α=0.67，从而建立HSIPS2多糖的Mark-Houwink方程［η］=9.67×10-3Mw0.67，根据参数α可推断出HSIPS2多糖在0.1 mol/L NaNO3溶液中的构象为柔顺链［19］。流体力学半径Rh与分子量Mw的关系Rh=KMwv可用于进一步推断多糖在溶液中的链形态［20］。由图7可知，以lgRh对lgMw作图得到一条线性直线，R2为0.9919，依据直线的斜率和截距求得K=1.16×10-2，ν值为0.56，根据参数ν同样推断出HSIPS2多糖在0.1 mol/L NaNO3溶液中的构象为柔顺链［19］。

图6　lg［η］对lgMw的对数图Fig.6　Logarithmic plot of Mwvs［η］

图7　lgRh对lgMw的对数图Fig.7　Logarithmic plot of Mwvs Rh

Yamakawa-Fujii-Yoshizaki（YFY）蠕虫链模型可用于计算分子链的刚性参数，参考Yang等［21］的方法，YFY模型关系可近似表达为：

B0为近似为常数，取值为1.05，A0可按下列公式计算：

Φ∞，0为Flory常数，dr≤0.1时，Φ∞，0=2.86×1023，ν为偏微分比容0.68 cm3/g。

由图8可知，以（Mw2/［η］）1/3对Mw1/2作一条关系曲线，得到Bohdanecký图。根据Bohdanecký图中的线性关系方程以及上述式（1）～式（6）公式可以计算得到刚性参数：ML=334.05 nm-1，q=0.70 nm，d=0.69 nm。ML值越大链的刚性越强，刚性链通常在500～2000 nm-1之间，因此，HSIPS2在0.1 mol/L NaNO3溶液中的构象为柔顺链，q=0.70 nm表明HSIPS2为无规则线团高分子链（0.5～1.0 nm），d=0.69 nm表明HSIPS2分子链为单链（＜1 nm）［22］。

图8　HSIPS2的Bohdanecký图Fig.8　The Bohdanecký plot of HSIPS2

2.4抗氧化活性

图9　VC和HSIPS2对羟自由基的清除率Fig.9　Hydroxyl radical scavenging activity of VCand HSIPS2

2.4.1羟自由基清除率如图9所示，在0.2～1.0 mg/mL浓度范围内，随着浓度的增大，VC和HSIPS2对羟自由基的清除能力越强；当浓度为1.0 mg/mL时，VC和HSIPS2对羟自由基清除力大小分别为99.01%和74.68%，VC和HSIPS2清除羟自由基的IC50分别为0.291 mg/mL和0.749 mg/mL，HSIPS2对羟自由基的清除能力要比VC弱，但是与Liu等［23］从中国被毛孢发酵菌丝体中分离纯化得到的多糖HSP-1相比较，HSIPS2对羟自由基的清除能力要稍高于HSP-1（IC50为0.834 mg/mL）。

2.4.2氧自由基吸收能力（ORAC）图10为标准品Trolox在不同浓度下的相对荧光强度衰退曲线，图11 为HSIPS2在15 μg/mL时的相对荧光强度衰退曲线。Trolox系列标准液标准曲线线性方程为：y=1.0581x+ 4.0779，R2=0.9991。根据标准曲线线性方程计算得到，HSIPS2的ORAC值为872.80μmolTE/g，高于Wojcikowski等［24］测得虫草ORAC值（117.28 μmol TE/g）。

图10　不同浓度Trolox标准品荧光衰退曲线Fig.10　Fluorescence decay curve affected by different concentration of Trolox

图11　HSIPS2多糖的荧光衰退曲线Fig.11　Fluorescence decay curve effected by HSIPS2

3　结论

发酵得到的中国被毛孢菌丝体经过提取分离及纯化后，得到新型多糖组分HSIPS2。HPLC测得HSIPS2单糖组成及摩尔比例为葡萄糖∶半乳糖∶甘露糖∶核糖=48.52∶6.58∶5.17∶1.0；采用静态光散射和动态光散射系统（SEC-MALLS）与在线差动式粘度计（ViscoStarTM II，Wyatt Technology，USA）联用，进行检测分析得知：HSIPS2分子量为1.463×104g/mol，纯度为99.82%，是一个低分散度，分子量较为均一的多糖；HSIPS2在0.1 mol/L的NaNO3溶液中呈柔顺链构象，构象参数：Rh=2.3 nm，ML=334.05 nm-1，q=0.70 nm，d=0.69 nm；同时，HSIPS2清除羟自由基的IC50为0.749 mg/mL，ORAC值为872.80 μmol TE/g，说明HSIPS2具有较高的体外抗氧化能力，多糖HSIPS2的高效活性可能受到其较低分子量、单糖组成和链构象的影响，但其机理尚未清楚。总之，HSIPS2可以开发为一种新的抗氧化添加剂应用到食品、化妆品和药品等行业。

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Chain conformation and antioxidant activity of a novel intracellular polysaccharide HSIPS2 from Hirsutella sinensis

SHAO Shuang-shuang1，HE Liang2，WEI Chao-yang1，LI Wei-qi1，*
（1.College of Life Sciences，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China；2.Institute of Biological Technology，Zhejiang Forestry Academy，Hangzhou 310023，China）

A novel intracellular polysaccharide，named HSIPS2，from Hirsutella sinensis was obtained by hot water extraction and alcohol precipitation，and then purified using DEAE-Sepharose Fast Flow chromatography and Sephacryl S-100 gel column chromatography.Its chain conformation and antioxidant activity were determined. The result showed that HSIPS2 was composed of glucose，galactose，mannose，and ribose with a molar ratio of 48.52∶6.58∶5.17∶1.0.It was proved to be a novel lower dispersion polysaccharide with uniform molecular of 1.463×104g/mol，and the purity was 99.82%.In 0.1 mol/L NaNO3aqueous solution，HSIPS2 existed as flexible chain conformation.The parameters of Rh，ML，q and d were 2.3 nm，334.05 nm-1，0.70 nm，and 0.69 nm respectively. Moreover，the IC50of its hydroxyl radical scavenging activity was identified to be 0.749 mg/mL and the value of ORAC was calculated to be 872.80 μmol TE/g.Hence，it was undoubtedly demonstrated that HSIPS2 exhibited potent antioxidant activity.

Hirsutella sinensis；polysaccharide；chain conformation；ORAC

TS201.2

A

1002-0306（2016）04-0200-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.032

2015－08－24

邵双双（1990-），女，硕士研究生，研究方向：微生物学，E-mail：shaoshuanger@sina.com。

李卫旗（1964-），男，博士，副教授，研究方向：天然产物加工，E-mail：liweiqi2014@sina.com。

浙江省科技攻关项目（2012C12004-4）；浙江省科技计划项目（2014C32085）。