直接免疫荧光法检测儿童呼吸道病毒抗原的结果分析

杨　泉，席金瓯

(湖北省妇幼保健院检验科，武汉 430000)



直接免疫荧光法检测儿童呼吸道病毒抗原的结果分析

杨泉，席金瓯△

(湖北省妇幼保健院检验科，武汉 430000)

目的评价直接免疫荧光法对儿童呼吸道病毒抗原的诊断价值，并探讨儿童呼吸道病毒的流行特征。方法用直接免疫荧光法检测6 282例住院儿童呼吸道分泌物中呼吸道合胞病毒(RSV)，流感病毒A型(FLUA)，流感病毒B(FLUB)，副流感病毒1型(PIV1)，副流感病毒2型(PIV2),副流感病毒3型(PIV3)和腺病毒(ADV)7种呼吸道病毒。结果6 282例标本中病毒阳性检出835例，总阳性率13.29%；其中RSV最高，阳性率8.83%；其次是PIV3，阳性率2.80%；冬季发病较高，夏季最少。0～6个月的幼儿发病率较高。结论直接免疫荧光法简单、快速，可用于儿童呼吸道病毒感染的早期诊断。

呼吸道感染；儿童；呼吸道病毒；直接免疫荧光

呼吸道病毒感染是常见感染性疾病，目前证明大部分是由病毒感染引起，呼吸道病毒感染以空气或飞沫形式传播。病毒种类繁多，症状相似，临床上很难鉴别[1]，因此快速鉴别呼吸道病毒抗原对儿童呼吸道感染的早期诊断、治疗和预后有十分重要的意义。

1　资料与方法

1.1一般资料选择2014年1～12月在湖北省妇幼保健院儿科住院的呼吸道感染患儿共6 282例，其中男3 451例、女2 831例，年龄0～12岁。春季1 651例，夏季1 289例，秋季1 544例，冬季1 798例。0～6个月1 342例，>6个月至1岁1 621例，>1～3岁1 852例，>3岁1 467例。

1.2仪器与试剂荧光显微镜由日本Olympus公司生产，检测试剂盒由美国的Diagnostic Huybrids.INC公司生产。

1.3方法

1.3.1标本采集使用无菌的8#婴儿输液软管收集鼻咽抽吸液，该软管与一次性的抽吸液采集管和抽液装置相连接，在患者处于仰卧体位时，将1～2 mL生理盐水注入患者鼻腔然后吸出。抽吸液和灌洗液应用等体积的运输培养基在装有无菌玻璃珠的离心管中稀释。

1.3.2细胞涂片制备剧烈漩涡标本10～15 s，(400～600)×g离心5～10 min，收集上清液并将其另置，用于病毒分离，加入5 mL的1×PBS，剧烈涡旋10～15 s，(400～600)×g离心5～10 min，并弃去上清液，重复数次，将沉淀加入0.5～1 mL的1×PBS液，剧烈涡旋15 s后在8孔的玻片上每孔分别加入25 μL标本悬浮液，将这些孔完全风干，冷丙酮固定。

1.3.3直接标本检测分别加一滴各种呼吸道病毒的荧光试剂于8孔对应的孔中，留一孔作为阴性，对于呼吸道抗原对照玻片分别加入一滴各种呼吸道病毒的荧光试剂于已标示的对应孔中，一起进行直接免疫荧光检测。

1.4原理采用荧光素直接标记的针对呼吸道病毒的特异性单克隆抗体，对呼吸道病毒进行快速检测和鉴定。该试剂盒包括1瓶呼吸道病毒荧光试剂，含有FITC标记的分别针对呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)、副流感病毒1～3型(PIV 1、2、3)、流感病毒A型(FLUA)、流感病毒B型(FLUB)的单克隆抗体混合物。另有分别含有针对相应病毒的单克隆抗体，该试剂盒可直接对标本或细胞进行检测。用于检测的细胞来自于临床标本，用丙酮固定载体上，呼吸道病毒荧光试剂被加于其上以检测是否有呼吸道病毒抗原存在。在35～37 ℃孵育后，用洗涤液进行洗涤，然后加上封固液，用盖玻片覆于其上。最后用荧光显微镜进行观察。病毒感染的细胞被染上绿色荧光，未感染上的细胞无荧光但会染上红色。如标本中有感染的细胞，则进一步用各种针对不同病毒的荧光试剂进行检测，以鉴定其感染的病毒种类。如果直接对标本检测未发现荧光标记的细胞并且所有细胞都被染成红色，将标本进行细胞培养并用呼吸道病毒荧光试剂复检。如果观察到阳性结果，再按照上述步骤进行鉴定检测，将细胞用丙酮固定于载体上，分别将各种针对不同病毒的荧光试剂加于其上，在35～37 ℃孵育后，用洗涤液进行洗涤。然后加一滴封固液，用盖玻片覆于其上，最后用荧光显微镜进行观察。病毒感染的细胞被染上绿色荧光，这样可以确定待检的呼吸道病毒的种类。

1.5统计学处理采用SPSS13.0统计软件进行数据处理，计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1病毒检出率6 282例患儿中检出呼吸道病毒感染835例，总阳性率为13.29%，其中RSV最高(8.83%，555/6 282)，其次PIV3(2.8%，176/6 282)、FLUA(0.7%，44/6 282)、ADV(0.35%，22/6 282)、FLUB(0.25%，16/6 282)、PIV1(0.24%，15/6 282)、PIV2(0.11%，7/6 282)。不同季节各类病原体检出率比较见表1。冬季发病最高(19.9%)，其次是春季发病(13.45%)、秋季发病(9.84%)，夏季发病最少(7.91%)。冬、春季增高，夏、秋季降低。

2.2不同年龄各类病原体检出率比较0～6个月发病率最高(20.86%)，其次>1～3岁(14.63%)和>6个月至1岁(13.51%)，>3岁的最低(4.43%)。见表2。

表1　　不同季节各类儿童呼吸道病毒检测率[n(%)]

表2　　不同年龄各类儿童呼吸道病毒检测率[n(%)]

3　讨　　论

急性呼吸道病毒感染是导致发展中国家儿童住院及死亡的常见疾病，RSV、FLUA、FLUB、PIV1、PIV2、PIV3、ADV感染是多发急性呼吸道感染的常见原因[2]。在诊断是否有细菌引起的呼吸道感染中，病毒检测变得越来越重要，采用荧光标记的单克隆抗体对直接抗原标本进行检测是病毒实验室的标准检测方法。呼吸道感染常为季节性的，流感病毒典型的流行期为冬季和春季，ADV常发于晚冬至早夏，RSV好发于早春和冬季，PIV则在全年都有可能发生。因此进行早期快速的呼吸道病毒检测十分重要。有研究证明呼吸道病毒抗原检测阳性结果的患者接受抗菌药物治疗的时间明显缩短，这样既可以减少抗菌药物的使用，又使住院时间缩短[3-4]。

目前诊断呼吸道病毒感染的方法较多。传统方法为电镜检测病毒颗粒，但阳性率低，诊断时间较长，且电镜难以在临床实验室普及；病毒分离培养过去常作为“金标准”，但费时、费力、要求高，很难常规普及；碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶(APPAAP)侨联酶标法，操作步骤繁杂易出现非特异性着色，阳性结果难以判断；血清学方法由于特异性抗体产生慢、滴度低。分子检测是呼吸道病毒检测的新标准，分子方法(如PCR技术)的灵敏度比组织培养方法高12%～30%，但PCR技术实验要求高，易污染[5]。寻求一种快速、简便的检测方法对儿童呼吸道感染的早期诊断有重要的意义。因此本研究用直接免疫荧光法检测儿童呼吸道病毒抗原，结果显示，病毒检出835例，总阳性率13.29%，检出率低于国内外大多数地区，如广州69.7%[6]，常州25.93%[7]，厦门42.5%[8]，可能本院是妇幼保健院病例较多的原因。其中RSV最高占总阳性8.8%，RSV是武汉地区的重要病原体，与国内外相关报道一致。RSV是儿童下呼吸道感染最常见的病毒体,婴幼儿最高,通常在冬春季节流行[9]。其次是PIV3占总阳性数的2.8%，ADV却不是武汉地区的主要感染原因。冬季发病较高，RSV检出284例(15.79%)最高，其次为FLUA检出40例(2.24%)；夏季RSV检出11例(0.85%)最少，PIV3检出74例(5.74%)最高。武汉地区冬季阴冷，早晚温差大，是儿童呼吸道病毒感染的高发季节，0～6个月的幼儿发病率较高，婴幼儿检测率高可能与婴幼儿期细胞免疫功能尚未完成，气道分泌物中缺少分泌型免疫球蛋白A(SIgA)有关，且血清中母体抗体降低，而自身产生的IgG水平不高有关[10]。这个阶段的幼儿免疫系统较弱，呼吸道黏膜还没有发育健全，较易发生感染。因此本研究用直接免疫荧光检测儿童呼吸道病毒抗原，方法简便、快速，为保证质量，在每次染色时，都同时需对一片未使用过的呼吸道病毒抗原对照玻璃片进行染色，以保证结果的可靠性。该方法准确可靠，值得推广，对儿童呼吸道感染用药具有指导作用，同时能监督并预测可能传播的病毒亚型，以指导疫苗的生产。

[1]侯云德．急性呼吸道病毒感染的病原学和防治[M]．北京：中国协和医科大学出版社，2005：6-10．

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[4]Rocholl C,Gerber K,Daly J,et al.Adenoviral infections in children:the impact of rapid diagnosis[J].Pediatrics,2004,113(1 Pt1):e51-e56.

[5]许琴，金涛，林素香，等．直接免疫荧光法检测儿童多种呼吸道病毒抗原的临床应用[J]．中国临床研究，2014，27(7)：868-870．

[6]朱美华，周志刚，温红艳，等．广州地区儿童呼吸道病毒感染流行情况及混合感染调查[J]．中国妇幼保健，2013，28(18)：2951-2955．

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[9]周长江．呼吸道合胞病毒感染流行病学研究[J]．实用儿科临床杂志，2002，17(4)：425-426．

[10]王莉佳，刘恩梅，赵晓东．重庆医科大学儿童医院急性呼吸道感染住院患儿病毒病原学分析[J]．中国实用儿科杂志，2005，20(12)：735-737．

,E-mail：xijinou@sina.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.053

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1673-4130(2016)16-2331-03

2016-03-27

2016-06-20)