聚合酶链反应在乙型肝炎母婴传播基因诊断中的应用研究

2016-09-14陈晓

国际检验医学杂志 2016年16期

关键词：孕产妇乙型肝炎定量

陈　晓

(福建医科大学附属第一医院输血科，福州 350005)

聚合酶链反应在乙型肝炎母婴传播基因诊断中的应用研究

陈晓

(福建医科大学附属第一医院输血科，福州 350005)

目的探究聚合酶链反应在乙型肝炎(简称乙肝)母婴传播基因诊断中的临床价值。方法使用聚合酶链反应对2014年3月至2015年3月收治的已感染HBV孕产妇108例与其新生儿股静脉血液HBV-DNA水平进行检测。结果单纯性乙肝患者血清内HBeAg阳性组的HBV-DNA水平明显比抗-HBc和抗-Hbe阳性组高，差异有统计学意义(P<0.05)。HBeAb阳性组和HBcAb阳性对照组中有部分患者的HBV-DNA水平较高，证实胎儿出现宫内感染的概率和母体血清HBV-DNA水平存在关联性，其母体中HBV-DNA水平升高，胎儿出现宫内感染的概率也就越大。结论使用定量检测的方式对孕产妇血液内HBV-DNA水平加以检测，可以全面反映出孕妇疾病的传染性，进而实现预计HBsAg阳性孕产妇胎儿出现宫内感染的风险强弱，之后有针对性地对高危人群实施治疗，全面减少其宫内感染的发生率。

宫内感染；乙型肝炎；荧光定量PCR；HBV-DNA；母婴传播

当前，乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)的母婴传播力已经成为学术界所关心的问题[1]。聚合酶链反应(PCR)首次由外国学者Saiki提出，该检测方式当前已经被应用在多种疾病的诊断，在诊断HBV感染方面也突显出重要地位。当前HBV子宫内感染已经被国内外学者所证实[2]。结合实际情况，本文选择2014年3月至2015年3月本院收治的已感染HBV的孕妇(108例)血清和新生儿静脉血HBV-DNA为研究标本，使用酶联免疫吸附试验(ELISA)对其血清乙肝标记物进行研究，全面观察孕产妇血清内HBV水平和胎儿宫内感染的关系，现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料选择2014年3月至2015年3月本院收治的已感染HBV孕产妇108例与其新生儿股静脉血液HBV-DNA为研究标本。年龄23.6～33.7岁，平均(27.4±3.6)岁。经临床诊断，孕产妇符合最新全国病毒性肝炎会议中制定的关于乙肝的诊断标准。所有孕妇均为单胎生产，新生儿平安降生。在其怀孕32周时，每月为其注射高价免疫球蛋白，并对其分娩前后的外周血加以采集，同时使用乙肝疫苗实施全程免疫。在新生儿出生之后1 d，将HBV-DNA或者HBsAg阳性视为宫内感染。现依照孕妇血清ELISA检测结果，将其分成HBeAg阳性对照组(64例)，HBeAb阳性组(25例)和HBcAb阳性对照组(19例)。各组受试者年龄等基线资料差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1HBV-DNA的定量检测本实验所使用的试剂盒均由北京诺康生物制剂有限公司生产，其引物序列为P1:5′-ATC CTG CTG CTA TGC CTC ATC TT-3′(23 bp),P2:5′-ACA GTG GGG GAA AGC CCT ACG AA-3′(23 bp)，荧探针的序列为5′-TGG CTA GTT TAC TAG TGC CAT TTG-3′(25 bp)。HBV-DNA的相关标准由本院诊断中心提供。本实验使用碱裂解法，在血清内提取出HBV-DNA[3]。将各个反应管放在全自动荧光检测设备中，扩增条件如下：在93 ℃环境中预变性2 min，后按照93 ℃ 45 s、55 ℃ 120 s做40个循环。使用德国西门子公司生产的全自动荧光PCR设备进行相关工作。在实施PCR过程中，持续性检测反应体系内的荧光信号改变情况，如果信号加强到某一个特定阈值(结合荧光信号基线平均值与标准值差，算出将99.7%置信度大于平均值，即为阈值)的时候，循环次数就会被记录，这个循环参数和PCR体系内初始DNA对数之间存在线性关系，后使用标准化HBV-DNA创建回归方程，结合标本的循环次数值，能够精准地算出DNA数量，经由计算机可分析出定量结果，最终值为对数值。

1.2.2质量控制各项试验中设置的双份阴性对照与5个含量不一的HBV-DNA阳性对照，在各个标准中选择两个孔当作计算结果，本实验使用Kwok提出的预防污染方式进行相关操作。

1.2.3HBV血清标志物检测对于该项标志物，本实验使用ELISA进行检测，试剂提供厂家为北京诺康生物制剂有限公司。

2　结　　果

2.1标准化HBV-DNA定量分析结果HBV定量阳性质量控制标准样品经过荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)，将初始复制数对数视为横坐标，将循环阈值当作纵坐标，可以得出直线型标准曲线，经计算，其斜率为-2.336。阳性关系系数为0.956 2。上述结果证实，使用循环次数实施定量的精准性。

2.2108例HBV感染者血清内HBV-DNA水平和标志物之间的关系血清HBeAg阳性对照组的HBV-DNA水平明显高于HBeAb阳性组与HBcAb阳性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。在阳性HBeAb阳性组和HBcAb阳性组内，一部分孕产妇HBV-DNA呈现出了较高水平。HBeAg阳性对照组，HBeAb阳性组和HBcAb阳性对照组的孕产妇血清HBV-DNA对数均值分别是4.98±1.02、3.62±0.88、2.96±1.06，两两相比，组间数据差异有统计学意义(P<0.05)。详情见表1。

2.3108例新生儿相关情况本次实验相关研究结果证实，105例新生儿的HBV-DNA水平在常规范围内，3例HBV-DNA水平为2.3×103copy/μL，与之相对应的标志物为HBeAg和HBcAb阳性，其母体的乙肝标志物为HBcAb、HBcAg和HBeAg，新生儿DNA定量情况为2.5×105copy/μL。在本次试验中，新生儿静脉HBcAb阳性共计43例。HBsAg和HBcAb阳性共计7例。HBcAb，HBsAb和HBeAb阳性共计3例。

表1　　单纯性HBV感染孕产妇血清HBV-DNA含量和标志物之间的关联性

注：HBV-DNA定量如果小于102，可以被视为阴性，无需计算在内。

3　讨　　论

随着我国医疗技术的不断进展，FQ-PCR已经成为了实施基因诊断的主要方式。从最早的斑点杂交法开始，到后来的PCR-ELISA等，PCR的定量精准性和假阳性污染为临床工作人员面临的两个难题[4]。这主要体现在以下两个方面：第一，使用上述方式实施检测，和各式各样的PCR后续处理分不开，这些处理过程会令数量庞大的PCR生成物弥散到空气中，进而出现假阳性现象[5]。第二，上述方式的定量法主要是针对PCR产物进行的，但PCR存在的平台效应在很大程度上影响了PCR初始数量与最终产物相关性，令精准性不佳，FQ-PCR以常规方式为基础，增加双标记探测针，一个标记于探针5′，被称之为荧光报告基团，另外一个标记于探测针3′,被称为荧光抑制剂基团，上述两个物质可以被构成能量传递结构[6]，探针在没有特异PCR出现时，荧光信号并不会发生改变，如果存在PCR扩增，探针会在PCR过程中被Taq酶5′-3′活性切断，抑制作用下降，报告基团荧光信号提升，伴随着PCR的进展，其产物越多，信号越强[7]。动态实时定量PCR就是基于上述原理进行的。和以往方式存在差异，这种方法使用全封闭测量，并不需要对PCR进行再次处理，以防止污染，在此同时也使用了动态检测技术，令Ct值和初始模板数量呈现出线性关系，有着较强定量精准性，另外使用电子监测的方式，替代既往观察，灵敏度得以提升[8]。

早在20世纪90年代，我国就实现了对新生儿的乙肝疫苗接种，使得新生儿罹患乙肝的概率明显下降，但值得说明的是，对于在宫内发生感染的新生儿，在出生后使用乙肝疫苗并没有特别显著的效果[9]，因此这部分新生儿极易演变成HBV携带者。造成宫内感染发生的原因相对复杂，当前还没有公认性较强的HBV宫内检测标准，目前学术界对新生儿肝脏组织内HBV-DNA检测较为理想，但这种方式实际操作起来相对困难[10]。

在本次试验中显示，孕妇的HBV-DNA感染阳性检出率较高，且呈现为三种表象，血清HBeAg阳性对照组的HBV-DNA水平明显比HBeAb阳性组与HBcAb阳性对照组高，差异有统计学意义(P<0.05)。在阳性HBeAb阳性组和HBcAb阳性组内，一部分孕产妇HBV-DNA呈现出了较高水平。

证实单纯性乙肝患者血清内的HBeAg可以代表HBV活跃性，FQ-PCR可在基因定量其水平进一步证明了HBeAg能够全面反映出乙肝复制水平，在本次试验中可证实，在出现宫内感染的患儿中，大部分患者的HBeAg呈现出阳性，且HBV-DNA水平较高，证实HBeAg阳性患者，其新生儿出现宫内感染的概率要比HBeAg阴性者大，证明两者之间存在较强关联性。

对于本试验中涉及的HBV-DNA阳性者，在HBeAb与HBcAb阳性组内，部分患者HBV-DNA水平超出常规，证实HBeAg水平减少和HBeAb与HBcAb水平上升并不能表示其病毒复制能力下降或者病情好转。

在本试验中，有个别案例呈现为HBeAg阴性但HBV-DNA水平提升，证实HBeAg阴性但HBV-DNA阳性者其新生儿依旧可能发生宫内感染。由此能够看出，使用母体HBV-DNA来判断其传染性和宫内发生感染风险更具有说服力。

综上所述，使用定量检测的方式对孕产妇血液内HBV-DNA水平加以检测，可以全面反映出孕妇疾病传染性，进而实现预测HBsAg阳性孕产妇胎儿出现宫内感染风险的强弱，之后有针对性地对高危人群实施治疗，全面减少其宫内感染发生率。

[1]李新新.人类白细胞抗原-DQB1基因多态性与家族性乙肝原发性肝癌相关性研究[D].太原：山西医科大学,2014.

[2]丁莉莎,陈曦,杨志军,等.湖南省HIV-1和HBV合并感染者中HBV基因亚型流行情况分析[J].中国艾滋病性病,2011,17(6):621-625.

[3]吕晓婷,王俊峰,臧嘉.乙肝病毒DNA与前S1抗原在产前检查中的意义[J].中国妇幼保健,2013,28(1):166-168.

[4]张树仁,王文蓉,赵丽华,等.应用PCR病毒定量评价免疫预防对阻断母婴垂直传播乙型肝炎价值的研究[J].放射免疫学杂志,2008,21(4):377-380.

[5]王文欢,曹建彪.乙型肝炎病毒相关性肝癌抗病毒治疗的现状[J].世界华人消化杂志,2013,21(5):415-420.

[6]王国婧,王刚,董小岩,等.用重组8型腺相关病毒载体介导的乙型肝炎病毒持续感染小鼠模型评价核苷类似物的抗病毒效果[J].生物工程学报,2013,29(1):95-106.

[7]廖祥伟,凌云,李新华,等.宿主IL28B基因型联合病毒基因型对慢性丙型肝炎抗病毒疗效的预测[J].中国病毒病杂志,2011(1):35-40.

[8]谢雯,闫杰,赵红.慢性乙型肝炎联合抗病毒治疗专家共识[J].中华实验和临床感染病杂志(电子版),2011,3(2):224-233.

[9]闫杰,谢雯.慢性乙型肝炎特殊患者抗病毒治疗专家共识:2014年更新[J].临床肝胆病杂志,2014,30(7):580-587.