血小板聚集功能检测方法及参数的探索与研究

楚杜武，任军伟，丛玉隆

(1.北京世纪坛医院检验科　100038；2.兵器工业北京北方医院检验科,北京 100089；3.解放军总医院西院检验科，北京 100853)



血小板聚集功能检测方法及参数的探索与研究

楚杜武1，任军伟2，丛玉隆3△

(1.北京世纪坛医院检验科100038；2.兵器工业北京北方医院检验科,北京 100089；3.解放军总医院西院检验科，北京 100853)

目的采用5种血小板聚集功能分析仪探讨研究血小板聚集功能检测的可靠方法与准确参数。方法利用二磷酸腺苷(ADP)诱导光比浊血小板聚集仪(LTA)实验，流式细胞仪(FC)血小板膜糖蛋白分子PAC-1(Fg、Ca2+、GPⅡb/Ⅲa形成复合物的受体)、CD62p(P选择素)活化百分率检测实验，英诺华PL-11血小板分析仪实验，VerifyNow抗血小板治疗监测系统实验(VerifyNow)与血栓弹力图实验(TEG)同时检测对照组与单服用氯吡格雷组的血小板聚集功能。结果(1)对照组与患者组ADP%，ADP激活的PAC-1、CD62p受体活化百分率，MAR%，INHI%，TEG测得ADP诱导的MA(mm)值6个参数差异有统计学意义(P<0.05)；BASE、P2Y12受体的PRU，凝血酶诱导的MA(mm)值3个参数差异无统计学意义(P>0.05)。(2)ADP%与(100-INHI)%，MAR%，ADP激活的CD62p、PAC-1受体活化百分率呈正相关(r分别是0.565、0.939、0.769和0.583，P<0.05)；与TEG测得ADP诱导的血小板聚集率值(%Agg)无相关性(r=0.127，P>0.05)。结论(1)氯吡格雷有抗血小板聚集的效果。(2)LTA操作便捷、廉价、结果稳定，在医院普及率高，是临床监测血小板聚集功能的首选方法。

血小板；流式细胞仪；血小板膜糖蛋白；二磷酸腺苷

目前，我国心血管疾病患者人数已超过2.7亿，按全国人口14亿计算，近5个中国人中就有1人罹患心血管疾病。氯吡格雷现在已经成为心血管病患者最常用的抗血小板药物之一，如何更有效、更准确掌握个体患者的服药效果，科学施治，就要求有更好的临床检验监测手段。当前，主要方法包括：光比浊法血小板聚集仪(LTA)实验是观察氯吡格雷药效的金标准[1]；流式细胞仪(FC)血小板膜糖蛋白分子检测是一种在分子水平观察血小板聚集功能的新方法；VerifyNow抗血小板治疗监测系统(VerifyNow)是近几年在国际上逐渐推广应用的新型比浊法抗血小板药物治疗监测系统；血栓弹力图(TEG)最早应用于输血的监测，目前经过改良后作为凝血监测方案已经在全世界40多个国家使用[2]。阻抗法连续监测血小板聚集的新型仪器包括英诺华PL-11分析仪等。这些方法各有怎样的优势和缺陷？本文通过对其功能与参数的对比、探讨，希望能够得出稳定、准确的测试方法及参数，使临床工作者选择准确、经济、有效、直接、快速的实验方法服务于患者。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂CHRONO-LOG MODEL700血小板聚集分析仪及其配套试剂(美国CHRONO-LOG公司)；BD FACSCalibur流式细胞仪(FC)及其配套原装试剂(美国BD公司)；VerifyNow抗血小板治疗监测系统(香港新仪仪器有限公司引进)及其配套光路质控板，试剂质控物，P2Y12阻断剂检测板，枸橼酸钠真空采血管；Thrombelastograph分析仪、配套高岭土试剂瓶及一次性测试杯(美国Haemoscope公司)；PL-11血小板聚集分析仪及配套试剂(南京神州英诺华医疗科技有限公司)；Thermo IEC CL40离心机(美国Thermo公司)；Sysmex XE-2100血细胞分析仪及其配套试剂(日本Sysmex公司)；枸橼酸钠抗凝管(美国BD公司)。

1.2观察对象及标本采集(1)使用随机数字法选取从2011年7～10月在解放军总医院健康体检的17例健康志愿者，其中男15例，女2例，年龄最大者69岁，最小者46岁，平均59岁；使用随机数字法选取2011年7～11月在解放军总医院心血管内科就诊的单独服用氯吡格雷(75 mg/d)10 d以上的心脑血管病患者10例，年龄最大者74岁，最小者49岁，平均61岁。(2)用5支3.8%枸橼酸钠抗凝和1支肝素抗凝真空采血管采集静脉血：5支3 mL，1支2 mL。其中1支3 mL枸橼酸钠抗凝血样在离心前先取出混匀全血5 μL用于FC血小板膜糖蛋白PAC-1、CD62p受体检测，然后进行英诺华PL-11血小板分析仪实验；2支3 mL血样进行LTA实验；1支2 mL血样进行VerifyNow实验；1支3 mL枸橼酸钠抗凝和1支3 mL肝素抗凝血样进行TEG实验。

1.3方法(1)二磷酸腺苷(ADP)激活FC血小板膜糖蛋白PAC-1、CD62p受体活化百分率检测：在室温24～28 ℃[3]，荧光素标记的抗血小板单克隆免疫荧光染色，在阴性对照管中加鼠IgG1-FITC、CD61-PE各20 μL，测定管中加入CD62P-FITC、PAC-1-FITC各20 μL，再分别加入5 μL全血。置室温避光反应15 min，立即加入110 mL1%多聚甲醛(2～6 ℃)混匀，2～8 ℃阴暗处放置30 min，立即上机获取数据，检测血小板膜糖蛋白PAC-1、CD62p受体活化百分数。(2)加入10 μmol/L ADP诱导剂进行LTA实验，用血细胞分析仪测定富血小板血浆(PRP)的血小板浓度，用贫血小板血浆(PPP)调整PRP血小板浓度为(200～300)×109/L[3]，检测ADP诱导血小板聚集率。(3)VerifyNow实验：先做光路质控，然后取2 mL的Verifynow专用枸橼酸钠抗凝真空采血管标本，于24～28 ℃稳定10 min[3]，上下颠倒混匀10次，倒插入分析仪中，3 min后打印结果。(4)TEG实验：运行ADP血小板图检测需采用3个通道，严格按照仪器说明书操作。第1个通道：枸橼酸化高岭土激活全血测试；第2个通道：A激活剂激活的样品测试；第3个通道：ADP激活样品测试，合成3个测试图得出血小板的氯吡格雷(ADP受体抑制药物)抑制率。(5)英诺华PL-11实验：将标本置于仪器的待测试位置，按“检测”键，直至仪器提示“加入诱聚剂”，用移液器抽取40 μL的诱聚剂加入标本中即可，等待测试完毕，打印结果。

1.4观察指标ADP诱导LTA测得血小板聚集率(ADP%)；FC测得ADP激活血小板膜糖蛋白PAC-1和CD62p受体活化百分率；VerifyNow测得血小板聚集基线(BASE)、P2Y12受体的Reaction Units值(PRU)，血小板聚集抑制百分数(INHI%)；TEG测得ADP诱导最大幅度(MA)(mm)值，凝血酶诱导MA(mm)值；英诺华PL-11测得最大聚集率(MAR%)。

2　结　　果

2.1对照组与患者组观察指标对比两组检测的ADP%，ADP激活的PAC-1、CD62p受体活化百分率， BASE、P2Y12受体的PRU，INHI%，TEG测得ADP诱导的MA(mm)值，凝血酶诱导的MA(mm)值，MAR%结果见表1。

表1　　各仪器测得对照组与单服氯吡格雷组参数对比

2.2LTA、FC、VerifyNow、TEG、PL-11测得所有观察对象相关性本实验观察对象的ADP%，ADP激活的PAC-1、CD62p受体活化百分率，INHI%，TEG测得ADP诱导的血小板聚集率值(TEGADP%)，MAR%统计学双变量相关性参数见表2。

表2　　LTA、FC、VerifyNow、TEG、PL-11测得所有观察对象相关性

注：*P>0.05，表示相关性差，且单变量方差分析斜率差异性检验P<0.05，即直线斜率、截距有差异；其他参数P<0.05，相关性良好，且单变量方差分析斜率差异性检验P>0.05，即直线斜率、截距无差异。

3　讨　　论

血小板活化后，颗粒膜蛋白CD62p、PAC-1活性显著性改变[4]。PAC-1与血小板表面的GPⅡb/Ⅲa和纤维蛋白原(Fg)结合[5]，在Ca2+的协助下发生血小板聚集[2]。所以，检测血小板聚集功能对于早期血栓形成的风险评估，阐明疾病的病理机制及临床治疗方案的选择有重要意义。

本实验中，5个仪器测得的健康对照组与单服氯吡格雷组参数对比，发现VerifyNow测得的PRU、BASE与TEG测得的MA(凝血酶)(mm)3个参数之间差异无统计学意义。可能原因：BASE是凝血酶通路的血小板聚集率，MA(凝血酶)(mm)也是凝血酶激活的血小板聚集幅度值，这两个参数无差异。这说明本次实验健康对照组与患者组在凝血酶引起的凝血功能方面差异没有统计学意义，但并不能下结论：凝血酶诱导的血小板聚集功能无差别。原因有二：(1)凝血酶是人体凝血系统最主要的节点，它不仅与血小板功能相关性强，与凝血因子的功能相关性也很强。此结果的产生很可能是两者共同合力的作用，本研究并未分析凝血因子方面的状况。(2)本实验中，观察例数还不足，普遍性有待进一步的研究。其他ADP%、ADP激活的PAC-1、CD62p受体活化百分率，INHI%，TEG测得ADP诱导的MA(mm)值6个参数有差异，证明氯吡格雷有一定的抗血小板聚集功能，但是抑制强度不强。可能是其药效比较温和，或者是与遗传变异性、患者依从性差、氯吡格雷剂量不足以及CYP3A4相关的药物间相互作用等因素有关[8]。从表2的结果可以看出其中相关性最好的是ADP%和MAR%。同时，ADP%与其他参数(TEG测得的%Agg除外)相关性都较好，说明了LTA是检查血小板聚集功能的良好方法。而其他仪器参数之间相关性一般，说明 VerifyNow、FC两种方法与LTA比较起来，优点并不明显。TEG结果和其他4种仪器的分析结果基本无相关性，原因有：(1)本实验的检测例数较少，偶然性较大；(2)此方法学存在缺憾。具体原因需要同行们进行更深入的研究。

综上所述，PL-11有一定的准确性与可靠性，可供临床选择；FC特异性好、灵敏度高，但费用昂贵，对操作技能要求高，可作为常规结果的辅助性确认；VerifyNow操作简便，适用于急诊、床边检验(POCT)；TEG展示凝血全过程，其中可发现各环节的缺陷与异常，适于凝血系统异常的观察判断。LTA操作便捷、廉价、结果稳定，在医院普及率高，是临床监测血小板聚集功能的首选方法。

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Investigation of detection methods for aggregation function of platelets

CHUDuwu1,RENJunwei2,CONGYulong3△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,BeijingShijitanHospital,Beijing100038,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,BeijingNorthHospitalofChinaNorthIndustriesGroupCorporation(CNGC),Beijing100089,China;3.DepartmentofClinicalLaboratory,WestBranchHospital,GeneralHospitalofPLA,Beijing100853,China)

ObjectiveTo adopt 5 kinds of platelets aggregation function analyzer to explore and study the reliable method for detecting the platelets aggregation function and accurate parameters.MethodsThe platelets aggregation function in the control group and the single clopidogrel group was simultaneously detected by utilizing the ADP induced light turbidimetric platelet aggregation analyzer (LTA) test,flow cytometry for PAC-1(receptor of Fg,Ca2+,GPⅡb/Ⅲa forming complex) and CD62p(P selectin) activation percentage detection test,Innova PL-11 for platelets analysis test,VerifyNow anti-platelet therapy monitoring system and thrombelastogram(TEG).Results(1)The 6-parameter differences of ADP%,PAC-1 and CD62p receptor activation percentage activated by ADP，MAR%，INHI%， ADP induced MA value(mm) detected by TEG had statistical differences between the control group and the case group(P<0.05);PRU of BASE and P2Y12 receptor,thrombin induced MA value (mm) had no statistical differences between these two groups(P>0.05).(2)ADP% was positively correlated with (100-INHI)%,MAR%,ADP activated CD62p and PAC-1 receptor activation percentage(r=0.565,0.939,0.769,0.583，P<0.05 );while which had no correlation with ADP induced platelets aggregation value(%Agg) detected by TEG(r=0.794,0.715,0.889).Conclusion(1)Clopidogre has the anti-platelets effect.(2)LTA is easily operating,cheap and stable in detection results,has high popularizing rate in hospitals and is the first option method for clinically monitoring the platelets aggregation function.

platelet;flow cytometry;PAC-1;CD62p;ADP

楚杜武,男,主管技师,主要从事医学检验工作。△

，E-mail：yulongc@263.net。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.025

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1673-4130(2016)16-2270-03

2016-02-28

2016-06-27)