外阴、阴道和宫颈尖锐湿疣组织中HPV感染的对比研究*

单慧敏，施启丰，耿建祥△，仲玉英，梅　静，龙秀荣，夏　林，王宏景，赵　雪

(1．江苏省大丰市人民医院病理科　224100；2.南京中医药大学第三附属医院病理科/江苏省HPV协作组，南京 210001)



外阴、阴道和宫颈尖锐湿疣组织中HPV感染的对比研究*

单慧敏1，施启丰2，耿建祥2△，仲玉英2，梅静2，龙秀荣2，夏林2，王宏景2，赵雪2

(1．江苏省大丰市人民医院病理科224100；2.南京中医药大学第三附属医院病理科/江苏省HPV协作组，南京 210001)

目的研讨外阴、阴道和宫颈尖锐湿疣(CA)组织中人乳头瘤病毒(HPV)感染型别的分布状况以及临床意义。方法应用基因芯片结合PCR技术对63例外阴尖锐湿疣、61例阴道尖锐湿疣和65例宫颈尖锐湿疣组织行23种HPV基因型检测，并分析患者的临床病理资料。结果63例外阴尖锐湿疣组织中检出HPV阳性者56例，HPV感染率为88.89%(56/63)；61例阴道尖锐湿疣组织中检出HPV阳性者55例，HPV感染率为90.16%(55/61)；65例宫颈尖锐湿疣组织中检出HPV阳性者62例，HPV感染率为95.39%(62/65)。结论HPV感染与外阴、阴道和宫颈尖锐湿疣的发病密切相关,HPV6和11是主流型别，以外阴尖锐湿疣最为常见。基因芯片结合PCR技术是适合应用于临床行HPV分型诊断的一种方法，具有敏感性好、特异性高的特点。对女性外阴、阴道和宫颈尖锐湿疣的临床诊断、治疗及其疫苗的研究具有重要的意义。

尖锐湿疣；人乳头瘤病毒；基因分型；外阴；阴道；子宫颈

人乳头瘤病毒(HPV)感染在外阴病变中所起的作用与在阴道和宫颈的病变很相似。在外阴部，这些病变包括湿疣性病变[尖锐湿疣(CA)和扁平湿疣]、外阴上皮内肿瘤形成(VIN)、浸润性鳞状细胞癌(包括尿道鳞状细胞癌)和疣状癌等。临床上，鉴于上述疾病的自然病程和治疗方法的明显不同，区分这些病变是非常重要的。对于这些疾病的诊断一定要行活组织病理检查，以明确其病理诊断，有利于临床妇产科医师对这类疾病的治疗及预后的判断。CA多发生于皮肤皱褶处，呈良性瘤样增生性病变。发生于肛门、外生殖器部位的，又称肛门生殖器疣(AGW)。在女性，外阴多灶发生，或在外阴、肛周或外阴、阴道、宫颈联合发生[1-3]。

1　材料与方法

1.1一般资料收集2011年1～12月在南京市中医院行宫颈活组织病理检查的20例病理诊断为轻度急、慢炎且鳞状上皮基本正常的宫颈石蜡包埋组织作为对照组，患者年龄24～65岁，平均37.05岁。收集1991年8月至2015年8月在南京市中医院妇产科手术的女性CA的石蜡组织标本，其中63例为外阴CA，患者年龄17～60岁、平均29.87岁；61例为阴道CA，患者年龄19～60岁、平均30.28岁；65例为宫颈CA，患者年龄19～71岁、平均29.34岁。病理切片均由2位高年资主治以上医师按照WHO妇科肿瘤的组织学分类标准进行复阅。

1.2仪器与试剂基因扩增仪为新加坡生产的Gene Amp PCR system 2400型；分子杂交仪为江苏省兴化市分析仪器厂生产的FYY-3型；高速冷冻离心机为德国生产的Eppendorf 5810 R型；生物安全柜为江苏省苏州市安泰空气技术有限公司生产的BHC-1300ⅡA2型；青岛海尔有限公司生产的-20 ℃冰箱等。HPV基因分型检测试剂盒,由亚能生物技术(深圳)有限公司提供。显色液须即用即配，根据需要的浓度用蒸馏水调配。

1.3方法

1.3.1标本的采集所有外阴、阴道和宫颈石蜡组织标本：先去除每例石蜡组织周边多余的石蜡，将其石蜡组织切成4 μm厚的切片，切3～5片石蜡组织即可。用专用的镊子轻轻夹取，放入小离心管中，切第2例石蜡组织前用次氯酸钠溶液擦刀片及镊子各3次。

1.3.2DNA的提取将切下的石蜡组织片放入1.5 mL离心管中，加入裂解液150 μL，充分振荡混匀，然后在金属浴中加热100 ℃ 10 min，立即13 000 r/min离心10 min后，取中间层DNA溶液待用。PCR扩增、杂交、孵育和显色按说明书进行规范操作。每份标本显色后根据杂交信号的有无来判断结果。

1.4统计学处理宫颈正常组织、外阴CA、阴道CA及宫颈CA组织中HPV感染率及各HPV型别的比例采用HPV分型统计软件(由南京倍宁医疗器械有限公司提供)进行分析，对分析出来的相关数据应用统计软件包SPSS13.0对相关数据进行统计学处理，百分率的比较采用χ2检验或确切概率法，显著性检验水准为α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

宫颈正常组织与外阴、阴道和宫颈CA组织的HPV阳性例数比较，差异均有统计学意义(χ2=44.89、46.42、59.94，P<0.01),而外阴、阴道和宫颈CA之间HPV阳性例数比较，差异均无统计学意义(χ2=0.05、1.87、1.29，P>0.05)。

2.1宫颈正常石蜡组织标本HPV检测结果从20例宫颈正常石蜡组织标本中检测出HPV阳性2例，均为一重感染(均为HPV6型)。

2.2外阴CA组织HPV检测结果63例外阴CA患者中阳性56例，总的HPV感染率为88.89%(56/63)。其中一重HPV感染35例，占总HPV感染率的55.56%(35/63)；一重HPV感染中HPV11型18例,其阳性检出率为28.57%(18/63)，HPV11型是最主要的感染型别，HPV6型14例,其阳性检出率为22.22%(14/63)。多重HPV感染21例,其中二重感染13例、三重感染7例、四重感染1例、六重感染2例，其HPV感染率为33.33%(21/63)；多重HPV感染中HPV6+16型、HPV6+52型和HPV11+31型各2例,分别占多重感染的3.17%(2/63),是多重感染的主要型别。63例外阴CA患者HPV阳性检出不同型别数合计92次，其中低危型出现61次，高危型出现31次。见表1。

2.3阴道CA组织HPV检测结果61例阴道CA患者中阳性55例，总的HPV感染率为90.16%(55/61)。其中一重HPV感染35例，占总HPV感染率的57.38%(35/61)，一重HPV感染中HPV11型20例,其阳性检出率为32.79%(20/61)，HPV11型是最主要的感染型别，其次是HPV6型13例,其阳性检出率为21.31%(13/61)。多重HPV感染20例,其中二重感染14例、三重感染3例、四重感染2例、五重感染1例，其HPV感染率为32.79%(20/61)；多重HPV感染中HPV6+11型4例,占多重感染的6.56%(4/61),是多重感染的主要型别，其次是HPV11+52型3例，占多重感染的4.92%(3/61)。61例阴道CA患者HPV阳性检出不同型别数合计85次，其中低危型出现62次，高危型出现23次。见表1。

2.4宫颈CA组织HPV检测结果65例宫颈CA患者中阳性62例，总的HPV感染率为95.39%(62/65)。其中一重HPV感染46例，占总HPV感染率的70.77%(46/65)，一重HPV感染中HPV11型29例,其阳性检出率为44.62%(29/65)，HPV11型是最主要的感染型别，其次是HPV6型14例,其阳性检出率为21.54%(14/65)。多重HPV感染16例,其中二重感染13例、三重感染3例，其HPV感染率为24.62%(16/65)；多重HPV感染中，HPV6+11型4例,占多重感染的6.15%(4/65),是多重感染的主要型别，HPV11+18型2例，占多重感染的3.08%(2/65)，是多重感染的其次型别。65例宫颈CA患者HPV阳性检出不同型别数合计81次，其中低危型出现65次，高危型出现16次。见表1。

表1　　外阴、阴道及宫颈CA HPV感染者不同型别感染频率及百分率的比较[n(%)]

注：对多重感染者，各型别的阳性率重复计算。

3　讨　　论

HPV是外阴、阴道和宫颈CA形成的必要因素，部分HPV型别可导致这些部位CA的瘤变和癌变[1，3-4],现已引起病理科和妇产科医师的高度重视，尤其是含有高危型或伴有高危型HPV感染的CA。因此，对外阴、阴道和宫颈CA组织行HPV分型检测意义重大。

湿疣是由HPV感染引起的性传播性疾病，通常是低危型，以6和11型为主，伴有少量的高危型[1，5-6]。CA是了解比较清楚的一型湿疣，大体特征为一个或多个隆起而质软的、大小不一的肿块。挖空细胞是诊断CA的重要依据，但不能作为唯一的依据，因为挖空细胞并非随时可表达，在病变的早期，挖空细胞尚未形成，而在病变的晚期，挖空细胞可能消退[1，3，6]。因此，现阶段，女性生殖器CA的诊断采用的是临床病史、病理组织学加HPV分型检测三结合的诊断法。

本研究提示：(1)20例正常宫颈组织中HPV阳性者2例。63例外阴CA患者中阳性者56例。61例阴道CA患者中阳性者55例。65例宫颈CA患者中阳性者62例。宫颈正常组织与外阴、阴道和宫颈CA组织的HPV阳性人数比较，差异均有统计学意义(P<0.01),而外阴、阴道和宫颈CA之间HPV阳性人数比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。(2)63例外阴CA组织中一重(35例)和多重(21例)感染之比为1.67∶1；61例阴道CA组织中一重(35例)和多重(20例)感染之比为1.75∶1；65例宫颈CA组织中一重(46例)和多重(16例)感染之比为2.88∶1。三者比较从外阴CA，到阴道CA，再到宫颈CA，其组织中一重HPV感染数与多重HPV感染数之比，呈现出逐步升高的趋势，这种现象是患者机体不同部位内外环境造成的，还是原本就是这种感染状况，还有待于大样本的研究。(3)从外阴、阴道和宫颈CA组织HPV感染分类来看，56例外阴CA HPV感染者中，低危型36例，低高危型18例，高危2例；55例阴道CA HPV感染者中，低危型40例，低高危型14例，高危型1例；62例宫颈CA HPV感染者中，低危型48例，低高危型10例，高危型4例。三组比较HPV感染都表现出从低危型到低高危型及高危型依次降低的现象，提示外阴、阴道和宫颈CA都是以低危型为主，低高危型和高危型为辅的感染模式。(4)从外阴、阴道和宫颈CA组织的高、低危型HPV感染出现率来看，56例外阴CA HPV感染者中，低危型出现61次，高危型出现31次，低高型感染之比为1.97∶1；55例阴道CA HPV感染者中，低危型出现62次，高危型出现23次，低高型感染之比为2.70∶1；62例宫颈CA HPV感染者中，低危型出现65次，高危型出现16次，低高型感染之比为4.06∶1。三组HPV感染频率比较都表现出低危型出现频率远多于高危型出现频率的状况，外阴、阴道和宫颈CA组织HPV感染，从女性生殖道由外向内，其病变的低高危型感染率之比随之增加，这是一种HPV感染的常态，还是女性生殖道内环境的使然，值得进行深入的研究。(5)2006年6月始，西方国家率先使用了以预防为目的的HPV疫苗来预防宫颈癌瘤[1，7-9]，如使用这种预防性疫苗(HPV 6、11、16、18型预防性四价疫苗)可起保护作用。本文外阴CA 62.50%(35/56)的患者(单一型感染者32例，多型感染者3例)、阴道CA 72.73%(40/55)的患者(单一型感染者33例，多型感染者7例)、宫颈CA 85.48%(53/62)的患者(单一型感染者44例，多型感染者9例)的女性可免遭这4型低高危HPV感染而诱发生殖道的CA，过半的女性生殖道CA患者可从中获益。(6)外阴、阴道和宫颈均可发生鳞状上皮内病变。鳞状上皮内病变可单独发生，也可在CA病变中发生。CA合并外阴、阴道和宫颈上皮内病变(VIN、VaIN和CIN)，尤其合并CINⅠ级和CINⅠ-Ⅱ级更为常见。现已证实，外阴、阴道和宫颈的鳞状上皮癌的发生与16和18型HPV感染最为密切[1，10-12]。因此，对患有外阴、阴道和宫颈CA的患者，妇产科医师一定要给患者行CA病变的活组织检查，一可明确诊断，二可及时发现有无伴有癌瘤情况，同时也要行CA组织HPV分型检测，对HPV16型和HPV18型的患者即使活组织检查正常，也要给予定期随访。

总之，女性生殖道CA是一类性传播性疾病，致病因子是HPV，降低其发病率要做到预防和治疗相结合[13-16]。预防女性生殖道CA的最好办法是尽早发现和治疗患者及其性伴侣，对高发病年龄段的群体进行卫生宣传和教育，并管控不良性行为，提倡广泛使用阴茎套以及男性和女性接种四价HPV(6、11、16、18型)预防性疫苗。这样多管齐下，防治并举，可最大限度地降低女性生殖道CA的发生率、瘤变率和癌变率，可造福于广大女性患者。

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A comparative study of HPV infection in condyloma acuminate tissues of vulva,vagina and cervix*

SHANHuimin1,SHIQifeng2,GENGJianxiang2△,ZHONGYuying2,MEIJing2，LONGXiurong2,XIALin2,WANGHongjing2,ZHAOXue2

(1.DepartmentofPathology,DafengMunicipalPeople′sHospital,Dafeng,Jiangsu224100，China;2.DepartmentofPathology,ThirdAffiliatedHospital,NanjingTraditionalChineseMedicalUniversity,Nanjing,Jiangsu210001,China)

ObjectiveTo study the distribution status and clinical significance of human papillomavirus(HPV) infection genotypes in condyloma acuminate(CA) tissues of vulva,vagina and cervix.MethodsThe gene-chips combined with polymerase chain reaction (PCR) technology were utilized for detecting 23 kinds of HPV genotypes in tissue specimens from 63 cases of vulval CA,61 cases of vaginal CA and 65 cases of cervical CA.Their clinical pathological data were analyzed.ResultsIn 63 cases of vulval CA,56 cases were HPV positive with the HPV infection rate of 88.89%(56/63),in 61 cases of vaginal CA,55 cases were HPV positive with the HPV infection rate of 90.16%(55/61),and in 65 cases of cervical CA,62 cases were HPV positive with the HPV infection rate of 95.39%(62/65).ConclusionHPV infection is closely related to the CA pathgenesis in vulva,vagina and cervix.HPV6 and HPV 11 are main stream genotypes,in which vulval CA is most common.The gene-chips combined with PCR technology is a method suitable for HPV typing diagnosis,and has the characteristics of good sensitivity and high specificity,which has an important significance for clinical diagnosis,treatment and vaccine study of CA in femal vulva,vagina and cervix.

condyloma acuminata；human papillomavirus；genotyping;vulva；vagina；cervix

江苏省南京市卫生局中医专项资助项目(2009-92)。

单慧敏，女，副主任医师，主要从事HPV感染相关性疾病的研究。△

,E-mail：dyc720@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.013

A

1673-4130(2016)16-2239-03

2016-03-25

2016-06-22)