ICU老年患者感染产ESBLs肺炎克雷伯菌的整合子耐药基因研究*

刘　唯,陈　键

(湖南省马王堆医院检验科，长沙 410016)



ICU老年患者感染产ESBLs肺炎克雷伯菌的整合子耐药基因研究*

刘唯,陈键△

(湖南省马王堆医院检验科，长沙 410016)

目的了解重症监护病房(ICU) 老年患者感染产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌整合子基因的分布及耐药率，为临床合理使用抗菌药物提供依据。方法采用法国生物梅里埃公司生产的VITEK-2微生物自动鉴定系统,对2013年1月至2015年12月老年ICU患者的各类临床标本进行细菌鉴定和药敏试验,产ESBLs肺炎克雷伯菌167株用PCR 分析整合子基因,并通过测序明确基因。结果肺炎克雷伯菌386株中产ESBLs检出率为43.26%；整合子检出阳性率50.89%,检出全为Ⅰ类整合子；整合子可变区扩增出aadA2、aadA1、aada16、dfra27和arr-3基因；产ESBLs 整合子基因阳性株耐药率明显高于整合子基因阴性菌株。结论老年ICU患者感染产ESBLs肺炎克雷伯菌和整合子基因密切相关，在细菌的耐药上整合子起着重要作用。

肺炎克雷伯杆菌；重症监护病房；产超广谱β-内酰胺酶； 整合子

重症监护病房(ICU)老年患者由于病情危重、免疫力低，进行气管插管、气管切开、留置导尿管、呼吸机使用等各种侵入性操作比例高、机体保护屏障破坏容易感染肺炎克雷伯菌[1],加之ICU患者广谱抗菌药物使用较多,整合子作为在重组功能上的移动元件,产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌通过质粒在体内传播而产生耐药性的改变，使产ESBLs菌获得多重耐药性[2],导致医院感染和其耐药率同时上升,成为了临床上治疗感染的难题[3]。笔者从本院2013～2015年ICU老年患者中,比较整合子基因在产ESBLs肺炎克雷伯菌中的分布及表型存在的情况,找出在产ESBLs菌耐药性整合子菌株在细菌耐药发挥的特点,指导临床对感染的老年ICU患者合理使用抗菌药物。

1　资料与方法

1.1一般资料收集2013年1月至2015年12月本院ICU病房患者(年龄>65岁)临床标本，分别为痰( 包括纤支镜吸痰、吸痰、自咳痰等)、肺泡灌洗液、血液、尿液等标本分离所得肺炎克雷伯菌(剔除重复检出的菌株)，同一患者的相同菌株收集标本时间在1 周内视为同一菌株，不做重复统计，共386株。呼吸道标本经涂片后选取合格标本进行培养采用法国生物梅里埃公司生产的VITEK-2细菌鉴定系统对病原菌进行鉴定及药敏试验。质控菌株：肺炎克雷伯菌ATCC700603,大肠埃希菌ATCC25922。

1.2仪器与试剂M-H琼脂和庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、左氧氟沙星、氨曲南、头孢西丁、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢他啶、哌拉西林、妥布霉素、哌拉西林/他唑巴坦、美洛培南14种药敏纸片由英国Oxoid公司生产的。试剂为大连宝生物工程有限公司提供的PCR扩增试剂盒。美国实时荧光定量Stepone基因扩增仪；DNA Thermal cycler,PE公司；美国海伦娜电泳仪。

1.3方法

1.3.1菌株鉴定及药敏试验所有样品均接种血琼脂和中国蓝双色平板。细菌培养采用法国生物梅里埃公司生产的API鉴定系统对菌株进行鉴定。用Kiady-Bauer纸片扩散法,按美国临床和实验室标准化协会(CLSI)2012年版本的标准判读药敏结果[4]。对产ESBLs菌株采用CLSI推荐的方法做初筛和确证检测试验。

1.3.2产ESBLs的整合子基因的PCR扩增及测序肺炎克雷伯菌用煮沸法提取整合子DNA，使用在PCR反应体系，扩增整合子基因，相关引物见表1。上海生工生物技术有限公司提供这些引物，扩增后产物送上海生工生物技术有限公司进行双向测序。对测序结果在DNA star 软件进行序列校正、结果拼接，通过在GenBank 数据库中进行BLAST比对，分析整合子可变区的基因序列的结果。

表1　　用于鉴定整合子类型设计的引物序列(5′-3′)

1.4统计学处理所有菌株的药敏结果均采用Whonet 5.6软件和SPSS20.0软件进行统计学分析。计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1菌株来源分布检测出产ESBLs为 167 株(检出率为43.26%)。肺炎克雷伯菌386株的标本来源中痰标本占51.5%,从肺泡灌洗液中检出产ESBL肺炎克雷伯菌为最高(55.43%)，见表2。

表2　　ICU老年患者检出肺炎克雷伯菌的标本来源分布

2.2整合子基因的检测结果在设计引物下扩增167株肺炎克雷伯菌的DNA，有85株整合子阳性菌被检出，阳性率为50.89%,在检出整合子中全都是Ⅰ类,并未检出含有整合子Ⅱ类或者整合子Ⅲ类。见图1。

注:1～7为检测株；阳性对照为肺炎克雷伯菌ATCC700603；阴性对照为大肠埃希菌ATCC25922。

2.3整合子阳性菌株可变区扩增的产物测序结果由整合子肺炎克雷伯菌扩增产物测序结果表明，Ⅰ类整合子扩增的可变区大小约为285 bp。与BLAST比对分析，Ⅰ类整合子可变区编码aadA2、aadA1、aada16耐药基因(介导氨基糖苷类抗菌药耐药)，二氢叶酸还原酶(dfra27)基因(对磺胺类抗菌药的耐药),以及对利福平耐药的ADP-核糖基转移酶1类整合子(arr-3)。

2.4整合子阳性和整合子阴性肺炎克雷伯菌对抗菌药物耐药率比较整合子阳性肺炎克雷伯菌对除阿米卡星以外的其他13种抗菌药物的耐药率明显高于整合子阴性肺炎克雷伯菌(P<0.05)；但在整合子阳性肺炎克雷伯菌耐药率统计中,有阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、美洛培南耐药率小于3%。见表3。

表3　　整合子阳性和整合子阴性肺炎克雷伯菌对抗菌药物耐药率比较

注：与整合子阴性肺炎克雷伯菌耐药率比较，*P<0.05。

3　讨　论

肺炎克雷伯菌在老年ICU患者感染的病原菌中排在第2位，且由于其质粒作用产生ESBLs,利用产物在细菌不同种之间进行传播扩散,加重老年ICU患者感染细菌的耐药性[5]。

对本院老年ICU患者感染肺炎克雷伯菌标本来源分布的情况进行分析，分离肺炎克雷伯菌最多的分别是痰、肺泡灌洗液和尿液,表明肺炎克雷伯菌通过老年人呼吸道和泌尿道更容易感染,这与文献[6]报道相似。其原因是肺炎克雷伯菌作为上呼吸道的定植菌，在各种因素如气管插管破坏口咽部正常定植的菌群后侵入造成逆向移行和易位感染，在患者未出现明显的感染征象时，做好肺炎克雷伯菌感染监测的同时加强医务人员手卫生依从性的教育，才能减少医院交叉感染的产生。

由于老年ICU患者因病情重,大剂量、长时间使用广谱及超广谱抗菌药物，引起宿主体内菌群的生态平衡失调,使得体内该菌产ESBLs不断增加。本院老年ICU患者感染肺炎克雷伯菌中有43.26%产ESBLs,尤其从肺泡灌洗液中分离出产ESBLs最高为55.31%,与有关报道不同[7],这样对于感染的控制和有效治疗造成较大困难,只有及时开展病原学检查,参照药敏结果选用抗菌药物,才能减少医院感染的产生。

在不断深入的细菌耐药研究中，越来越多重视整合子介导的耐药性,整合子有特异性的识别位点捕获游离的耐药基盒,在自身染色体或者质粒上同一方向整合[8],整合子再通过转座子或接合性质粒介导耐药基因水平传播和转移而导致耐药。肺炎克雷伯菌存在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子,本研究中85株肺炎克雷伯菌整合子阳性菌来自于167株产ESBLs的肺炎克雷伯菌,检出结果均为Ⅰ类整合子,并未发现Ⅱ﹑Ⅲ类整合子,这结果与文献[9]报道的肺炎克雷伯菌中Ⅰ类整合子的多重耐药基因的结果基本一致。说明老年ICU患者感染产ESBLs的肺炎克雷伯菌中有Ⅰ类整合子,这样容易形成多重耐药菌株,导致老年ICU患者感染的整合子阳性菌对13种药物耐药率与整合子阴性菌的耐药率相比差异有统计学意义(P<0.05)。通过本研究整合子阳性菌株可变区扩增的产物测序结果与BLAST比对发现，Ⅰ类整合子可变区编码aadA2、aadA1、 aada16、 dfra27和arr-3耐药基因,说明这些整合子阳性的菌株不仅对三代头孢在内的β-内酰胺类抗菌药物出现耐药，对氨基糖苷类和喹诺酮类抗菌药物也会出现耐药，其原因是在播散过程中整合子的产ESBLs菌株存在有β-内酰胺类抗菌药物所起到的筛选效应[10],其他耐药基因黏附在其整合子上形成接合性质粒在筛选ESBLs基因中发生作用，促进某些ESBLs编码基因位于整合子内部，形成高耐药基因,促进ESBLs的传播。

综上所述，应加强对产ESBLs的细菌整合子基因检测和耐碳青霉烯类抗菌药物细菌的专项监测，微生物室及时把监测结果反馈至临床，这样有利于临床加强医务人员的手卫生管理,做好环境卫生及物品消毒，采取消毒隔离措施,避免耐药菌的交叉传播,延缓细菌耐药性的出现。

[1]王惠姣，徐娇君，陈小平，等．ICU患者感染多药耐药肺炎克雷伯菌的耐药性分析[J]．中华医院感染学杂志，2016，26(6)：1235-1237．

[2]王元元，张昭勇，吕军．下呼吸道感染肺炎克雷伯菌耐药性及产ESBLs株危险因素分析[J]．湖北医药学院学报，2014，33(3)：248-252．

[3]郝家砚，程邦宁．产ESBLs肺炎克雷伯菌的整合子介导耐药的研究[J]．国外医药抗生素分册，2014，35(1)：16-18．

[4]Clinical and Laboratory Standards Institute．Performance standards for antimicrobial susceptibility testing:twenty-second informational supplement：M100-S22[S]．Wayne，PA，USA：CLSI,2012.

[5]卢赛飞，张建礼．415株肺炎克雷伯菌的临床分布及耐药性分析[J]．国际检验医学杂志，2014，35(22)：3076-3077．

[6]张爱勤，孙红艳．住院患者肺炎克雷伯菌感染及其耐药性监测[J]．中国消毒学杂志，2014，31(6)：642-643．

[7]胡志军，潘晓龙，周东升，等．肺炎克雷伯菌感染的临床分布及耐药性监测[J]．中华医院感染学杂志，2014，24(12)：2865-2867．

[8]Cambray G,Guerout AM,Mazel D.Integrons[J].Annu Rev Genet，2010,44:141-166.

[9]Roy Chowdhury P,Ingold A,Vanegas N,et al.Dissemination of multiple drug resistance genes by class 1 integrons in Klebsiella pneumoniae isolates from four countries:a comparative study[J].Antimicrob Agents Chemother,2011,55(7):3140-3149.

[10]王玉红，邓敏，闵晓春．产ESBLs肺炎克雷伯菌临床分布特征及耐药性分析[J]．中华医院感染学杂志，2014，24(21)：5213-5214．

Study on integron drug resistance gene of ESBLs-prodcing Klebsiella pneumonia infection in ICU elderly patients*

LIUWei，CHENJian△

(DepartmentofClinicalLaboratory,HunanProvincialMawanduiHospital,Changsha,Hunan410016China)

ObjectiveTo understand the gene distribution and drug resistance rate of integron gene of extended spectrum β- lactamases(ESBLs) producing Klebsiella pneumonia infection in ICU elderly patients in order to provide the basis for rational use of antimicrobial agents.MethodsThe BioMerieux VITEK-2 Automated Microbes Identification System was adopted to conduct the bacteria identification and drug susceptibility test on various clinical specimens of ICU elderly patients in our hospital from January 2013 to December 2015.The integron gene in 167 strains of ESBLs-producing Klebsiella pneumoniae was analyzed by PCR,and the gene was identified by sequencing.ResultsAmong 386 strains of Klebsiella pneumoniae,the detection rate of ESBLs-producing strains was 43.26%;the positive rate of integron was 50.89%,the detected integron was class Ⅰ integron;aadA2,aadA1,aada16,dfra27 and arr-3 genes were amplified from integron variable region;the drug resistance rate of ESBLs-producing integron gene positive strains was significantly higher than that of integron gene negative strains.Conclusionthe ICU elderly patients with ESBLs-producing Klebsiella pneumoniae infection is closely related to the integron gene and integron plays an important role in bacterial drug resistance.

Klebsiella pneumoniae;ICU;ESBLs producing;integron

湖南省科技计划项目(2013FJ3115)。

刘唯，女，主管技师，主要从事微生物检验及细菌耐药性研究。△

，E-mail：chenjian9240@126.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.004

A

1673-4130(2016)16-2214-03

2016-04-03

2016-06-07)