随机质心映射优化法（RCO）提取皮亚曼石榴皮中黄酮类化合物

孟新涛，潘 俨，许铭强，马晓雯，李德华，薛素琳，张 平（新疆农业科学院农产品贮藏加工研究所，新疆乌鲁木齐830091）

随机质心映射优化法（RCO）提取皮亚曼石榴皮中黄酮类化合物

孟新涛，潘 俨，许铭强，马晓雯，李德华，薛素琳，张 平*
（新疆农业科学院农产品贮藏加工研究所，新疆乌鲁木齐830091）

利用随机质心映射优化法（RCO），以乙醇浓度、超声时间、提取温度和料液比为影响因子，研究新疆皮亚曼石榴皮中黄酮类化合物的超声波提取工艺。结果表明：经过RCO两轮循环后得出超声波法提取石榴皮中黄酮类物质最佳工艺：乙醇浓度为87%、超声时间为37 min、提取温度为59℃、料液比为1∶24（g/mL）。优化后皮亚曼石榴皮中总黄酮的得率为25.56%。经过相关性分析得知，提取温度和乙醇浓度对总黄酮的得率影响较大，且呈负相关，表明皮亚曼石榴皮中黄酮类化合物的极性较大。当石榴皮黄酮浓度为12 mg/mL时，对DPPH自由基的清除率可达91.6%。

皮亚曼石榴，随机质心映射优化，超声波提取，黄酮，抗氧化性

皮亚曼石榴为石榴科，产自新疆和田皮山县，是新疆特色水果之一。石榴具有良好的抗氧化、调节血脂、预防动脉粥样硬化、预防癌症、抗衰老、降血脂和延缓食品发生氧化等功效［1-3］。其主要功效因子是石榴中的黄酮类物质。黄酮类化合物对人体有多种生理功能且不良反应少，是一类安全可靠、成本低、来源广的营养物质，有较大的开发和应用前景［4］。研究证明，黄酮类化合物广泛存在于石榴的各个部位，但石榴皮中存在的黄酮类物质远大于石榴籽中，同时石榴皮占石榴总重超过30%［5-7］，所以提取石榴皮中的黄酮类化合物尤为重要。

超声提取黄酮类化合物时，不同的超声频率、超声时间及提取温度对有效成分的提取都有影响［8］。郭青枝等［9］用超声波法提取了苦瓜中的黄酮，用正交实验优化工艺，使提取量为传统提取方法的1.36倍。邓光辉等［10-11］进行了超声波法乙醇提取山楂叶黄酮的研究，提取率为91.39%。与常规索氏提取相比，超声提取法操作简单且能达到较高的提取率。研究表明，超声波辅助提取，能使目标提取率提高。正交设计法在有效成分提取方案优化过程中使用最多，但此方法每次只能针对一个单因素进行单独考察，工作量大，耗时耗力，实验成本过高［12］。随机质心优化法（RCO）在实验过程中无需单因素实验考察即可对工艺条件进行优化，尤其对具有多种因素的实验方案的优化较为实用［13］。超声波提取黄酮类化合物时，影响因素多且因素取值范围大，利用RCO能够对实验工艺全局优化的特点，在RCO辅助优化软件中输入因子上下限，开始实验设计，可以在较少的实验次数内完成工艺的优化。

本文采用RCO辅助优化软件，对提取皮亚曼石榴皮中黄酮类化合物的条件进行优化。并测定了总黄酮清除DPPH自由基的能力，考察了石榴皮中黄酮的抗氧化性。旨在为石榴皮中有效活性物质的提取提供理论基础，为进一步开发利用石榴资源提供可靠的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

皮亚曼石榴 新疆乌鲁木齐南昌路北园春市场购买，洗净后去皮，剔除褐变及腐烂部分果皮，置于40℃恒温干燥箱内烘干，用研磨机粉碎，过100目筛，储存于干燥器中避光保存备用；槲皮素、芦丁（纯度≥98%） 北京世纪奥科生物技术有限公司；乙醇、石油醚、三氯化铝、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠 天津市致远化学试剂有限公司，分析纯。

UV260紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；旋转蒸发仪 上海亚荣旋转蒸发；IKA®A11基本型研磨机 广州仪科实验室技术有限公司；pHS-3C型酸度计 上海雷磁仪器厂；SK720H型超声波清洗器 上海科导超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 石榴皮中黄酮类化合物提取的工艺流程 皮亚曼石榴皮→干燥→粉碎，过100目筛→称取1.0 g石榴皮粉末95%乙醇溶解→常温超声30 min→减压旋蒸回收→石油醚萃取2次→定容，备用。

1.2.2 吸收波长的确定 通过NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法确定芦丁标准品和样品的最大吸收波长，在400～700 nm范围内进行全波长扫描。考虑到黄酮类化合物种类繁多、结构类型复杂，极性大小不同，最大吸收波长各不相同等特性，选择槲皮素为对照品，将槲皮素标准品与样品的乙醇溶液在300～600 nm波长范围进行全波长扫描。

1.2.3 标准曲线的绘制 将槲皮素标准品真空干燥，精密称取2.000 mg，30%乙醇溶解定容至50 mL容量瓶中，得浓度40 mg/L的槲皮素标准品溶液。取槲皮素对照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，配制成浓度为4、6、8、10、12、14 mg/L的系列标准溶液。在372 nm处，利用紫外分光光度计法测定槲皮素浓度（C）与吸光度（A）之间的关系［13］。得线性方程为：A= 0.05797C+0.02826，R2=0.9985。

1.2.4 石榴皮中总黄酮得率的测定 精密吸取样品溶液1.00 mL，置于25 mL容量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，摇匀。按照标准曲线法在最大吸收波长372 nm处测定其吸光度，由标准曲线方程计算溶液中黄酮类化合物的质量浓度，再计算出皮亚曼石榴皮中总黄酮的提取得率（ω）［7］。计算公式为ω（%）=（C×V×D/ W）×100，式中C为样品溶液质量浓度（mg/mL）；V为所测样品溶液总体积（mL）；D为所测样品溶液稀释倍数；W为样品质量（g）。

1.2.5 RCO对提取因素和实验方案的辅助优化 RCO辅助优化过程为：输入因子上下限，开始第一轮实验设计，首先开始随机搜索选择（random search），得出一系列优化随机实验点，完成随机实验，将作为评价指标的实验结果输入软件结果因子中，开始质心校验选择（centroid search），得出质心搜索结果，实验结果以提取液中总黄酮得率为评价标准。利用映射优化（mapping optimization）作图来找出最佳提取工艺，映射优化图中横坐标箭头所指的数值为每个因素所对应的最佳值。从映射优化图中映射结果分散与否来判断是否需要第二轮、第三轮循环［14-17］。

超声波法提取不同果品黄酮类化合物时，优化的最佳单因素范围较大，乙醇浓度通常在50%～95%之间，提取温度通常在25～70℃之间，提取液料比在1∶10～1∶30之间［18-19］，根据总黄酮提取文献报道［8-9］的提取因素及其范围，确定超声波法提取皮亚曼石榴皮中总黄酮得率的因素及变化范围为：乙醇体积分数30%～95%，提取温度25～70℃，提取的料液比1∶10～1∶30（g/mL），超声时间20～60 min，以黄酮的提取得率为考察指标。

利用质心优化设计软件对乙醇浓度、提取温度、料液比和超声时间四个因素进行设计，上下限范围见表1。

表1 待优化因子的上下限范围Table1 Range of optimization factors for RCO

1.2.6 对DPPH自由基的清除能力 参照刘建英［8］文献并略加改进，取3 mL 0.04%DPPH的乙醇溶液，加入一定浓度黄酮提取液1.0 mL，混匀后避光放置30 min，在波长为517 nm处，测定吸光度值，读取试样的OD（试样）值。用1.0 mL无水乙醇替代黄酮提取液作为空白组，测定其吸光值OD（空白）。清除率计算公式为：清除率（%）=［1-OD（试样）/OD（空白）］×100。

1.2.7 羟基自由基的清除能力 采用亚铁离子催化过氧化氢产生羟基自由基的方法［20］。取l mL 0.75 mol/L邻二氮菲溶液，PBS（pH=7.4）缓冲液2 mL，蒸馏水l mL，混匀作为本底溶液，加0.75 mol/L硫酸亚铁l mL，加0.01%的过氧化氢l mL，于37℃保温60 min，于波长为536 nm处测其吸光度，其值为Ap。用30%的乙醇代替过氧化氢，测得吸光度为AB。用试样代替蒸馏水，测得吸光度As。·OH自由基清除率（d）计算公式：d（%）=（AS-AP）（/AB-AP）×100。

1.3 数据处理

实验中总黄酮的提取率、标准曲线的测定、抗氧化性的测定次数均≥3，实验数据采用Origin 8.0和SPSS 16.0来处理，结果以平均值±标准偏差来表示。

2 结果与分析

2.1 吸收波长的确定

如芦丁标准品在可见光范围的最大吸收波长为510 nm，但样品溶液在510 nm处并无最大吸收峰，光谱扫描结果（见图1）。而样品与槲皮素对照品在372 nm处有相同的最大吸收波长，且无其他杂峰干扰。所以本文确定测定皮亚曼石榴皮黄酮类化合物的最大吸收波长为372 nm。

图1 标准品与样品的扫描光谱图Fig.1 Scanning spectra of standards and sample

2.2 石榴皮提取物中总黄酮得率的测定结果

精确吸取样品溶液1.00 mL，置于25 mL容量瓶中，同时做3个平行样。按标准曲线法分别测定吸光度，根据计算公式得出石榴皮提取物中黄酮提取得率。结果显示（见表2），皮亚曼石榴皮提取物总黄酮得率为12.24%，相对标准偏差为2.94%。表明皮亚曼石榴皮提取物中总黄酮得率较高。

表2 样品中总黄酮得率测定结果Table2 Determination results of real samples

2.3 RCO优化条件的设计

选择乙醇浓度、提取温度、提取的料液比和超声时间为RCO优化的四个因素，分别将其上下限输入到RCO程序，程序设计出第一轮随机实验条件，共9组，按照条件完成实验，将实验结果输入程序，程序将实验结果作为评价依据，判断优化趋势，再次设计出质心搜索实验，共4组实验方案，依照顺序进行实验得到提取物，计算提取物目标值。第一轮循环实验设计结果见表3。

将第一轮随机搜索和质心搜索实验结果输入RCO程序，针对提取目标进行优化条件映射，得出第一轮优化条件映射图见图2，其每一个影响因素对应一个映射优化图。图2中横坐标箭头所指处为该影响因素的最佳取值，可以看出，直线和曲线都集中指向该因素的最佳值［9］。由第一轮优化条件映射图中箭头所指位置可知，提取皮亚曼石榴皮中总黄酮的提取工艺优化结果为：提取温度为59℃，最佳超声时间为26 min，最佳料液比为1∶24（g/mL），乙醇浓度为88%。但图2中映射结果比较分散，所以设计第二轮循环实验，以便得出最佳优化工艺。

表3 随机实验方案Table3 The proposed factor values given by RCO

以第一轮循环结果为参考依据，输入第二轮循环实验因子上下限（见表1），依照第一轮随机实验设计方法得出第二轮实验方案，随机实验共7组，质心实验共4组，实验结果见表4。

图2 第一轮优化条件映射图Fig.2 Mapping results of drawn by RCO in the first round

表4 随机实验方案Table4 The proposed factor values given by RCO

经过第二轮随机实验优化后，对实验结果采用RCO软件进行优化条件映射，总黄酮得率的提取得率略低于第一轮循环实验结果，但优化点、曲线和直线指向较集中。图3中的曲线和直线为趋势线，均指向最佳区域。横坐标上的箭头指明了最优值。得出第二轮随机实验优化最佳提取工艺为：提取温度为59℃，最佳超声时间为37 min，最佳料液比为1∶24（g/mL），乙醇浓度为87%。此结果与第一轮随机实验优化结果的最佳提取条件基本一致。

2.4 验证实验

以上述优化后的最佳提取工艺提取石榴皮中黄酮类化合物，即提取温度为59℃，最佳超声时间为37 min，最佳料液比为1∶24（g/mL），乙醇浓度为87%。测定总黄酮得率，得黄酮得率平均值为25.56%，RSD 为2.52%，较优化前方案（见方法1.2.1）提取总黄酮得率（12.24%）高出一倍。经验证，随机质心优化程序（RCO）优化实验结果准确可靠。

2.5 黄酮类化合物提取率与各因素之间的相关性分析

表5 总黄酮得率与四个因素的相关性分析Table5 Flavonoids content and four factors of correlation analysis

为了进一步了解石榴皮中黄酮类化合物的提取得率与乙醇浓度、提取温度、料液比和超声时间之间的相关性，进行总黄酮得率与各因素之间的相关性分析，从表5可以看出，总黄酮得率与提取温度呈显著负相关（p＜0.05），与乙醇浓度、料液比和超声时间都无显著相关性，但乙醇浓度的变化对总黄酮得率影响较大。此结果表明：石榴皮提取液中总黄酮提取得率随着乙醇浓度和提取温度的增加反而降低，根据“相似相溶”原理，说明皮亚曼石榴皮中可能存在的黄酮类化合物极性较大。

图3 第二轮优化条件映射图Fig.3 Mapping results of drawn by RCO in the second round

2.6 对DPPH自由基的清除能力评价

图4所示为黄酮类化合物清除DPPH·自由基的测定结果。

从图4可以看出，石榴皮中黄酮类化合物具有较强的清除活性，并且清除能力随着浓度的增大而增强，当浓度为12 mg/mL时，清除率为91.6%，之后随着浓度的增大清除率增大并不明显。

2.7 羟自由基的清除能力的评价

如图5所示，石榴皮总黄酮具有一定的清除羟自由基的能力，且效果随着总黄酮浓度的增加而增强。当总黄酮的浓度达到20 mg/mL时清除羟自由基的能力最强，清除率达到78.8%，之后随着浓度的增加，清除能力增加不明显。

图4 提取物对DPPH自由基的清除效果Fig.4 The DPPH scavenging activities of extractive

图5 提取物对羟自由基的清除效果Fig.5 The OH·scavenging activities of extractive

3 结论与讨论

经过RCO两轮循环后得出超声波法提取石榴皮中黄酮类物质最佳工艺：乙醇浓度为87%、超声时间为37 min、提取温度为59℃、料液比为1∶24（g/mL）。优化后皮亚曼石榴皮中总黄酮的提取得率为25.56%。在提取的四个影响因素中，提取温度及乙醇浓度对黄酮得率影响较大，且随乙醇浓度的增大提取率下降。黄酮类物质清除DPPH自由基的能力较强，清除能力随着浓度的增大而增强，当浓度为12 mg/mL时，DPPH自由基的清除率为91.6%。

［1］武云亮.石榴资源的开发利用与产业化［J］.资源开发与市场，1999，15（4）：208-209.

［2］许宗运，蒋慧，吴静，等.石榴皮和石榴渣总黄酮提取率的测定［J］.中国农学通报，2003，19（3）：72-74.

［3］Mira Rosenblat，Tony Hayek，Michael Aviram.Antioxidative effects of pomegranate juice（PJ） consumption by diabetic patients on serum and on macrophages［J］.Atherosclerosis，2006，187：363-371.

［4］孟甄，孙立红，陈芸芸，等.石榴叶鞣质对高血脂高血糖模型动物脂代谢的影响 ［J］.中国实验方剂学杂志，2005，11 （1）：22-24.

［5］Filomena de Nigris，Sharon Williams-Ignarro，Vincenzo Sica，et al.Effects of a Pomegranate Fruit Extract rich in punicalaginon oxidation-sensitive genes and eNOS activity at sites of perturbed shearstress and atherogenesis［J］.Cardiovascular Research，2007，73：414-423.

［6］张笑颖.新疆石榴皮化学成分的基础研究［D］.乌鲁木齐：新疆医科大学，2008.

［7］郭永谊，黄汉，黄晓丹.石榴不同品种及部位总黄酮提取率分析［J］.亚太传统医药，2011，10：20-22.

［8］刘建英.全叶青兰挥发性成及黄酮类化合物的研究［D］.乌鲁木齐：新疆大学，2013.

［9］郭青枝，赵二劳，陈婕.正交实验优选苦瓜黄酮超声波提取工艺［J］.酿酒科技，2007（1）：36-37.

［10］兰昌云，周崇松，范必威，等.超声波法提取槐花中黄酮的最佳工艺研究［J］.天然产物研究与开发，2005（1）：55-58.

［11］邓光辉，周桂，刘榕城.超声波法乙醇提取山楂叶黄酮的研究［J］.广西轻工业，2007（1）：1-2.

［12］吴夏，张盛，景浩.随机质心映射优化法在五味子多酚优化提取中的应用［J］.食品科学，2012（22）：341-347.

［13］蒋莉，祁英，刘玉梅.随机质心映射优化法对新疆雪菊中黄酮和多酚提取工艺的研究［J］.食品工业科技，2014（17）：258-261，342.

［14］Nakai S.Comparison of optimization techniques for application to food product and process development［J］.Journal of food science，1982，47（1）：144-176.

［15］Nakamura K，Hatano S，Matsuoka A，et al.Optimum condition of high pressure treatment for the preparation of lysozyme-dextran complex found by random-centroid optimization ［J］.Food science and technology research，2001，7（1）：84-87.

［16］尹秀梅，陈丽艳，张学武.水红花子中槲皮素的含量测定［J］.延边大学医学学报，2005（4）：264-265.

［17］沈棚，黄敏欣，白卫东，等.随机质心衍射优化酶法去除客家娘酒中氨基甲酸乙酯工艺［J］.食品科学，2013，22：40-43.

［18］刘素果，任琪，温媛媛，等.石榴果皮总黄酮的提取工艺［J］.经济林研究，2010（3）：62-68.

［19］吴佳，解成喜.石榴皮总黄酮的提取工艺及抑制亚硝化反应［J］.食品科学，2011（2）：111-114.

［20］王世永，李小定，吴谋成.荧光化学发光法研究吴茱萸精油的抗氧化作用［J］.食品科技，2008，33（2）：206-208.

［21］Ogawa M，Nakamura S，Scaman C H，et al.Enhancement of proteinase inhibitory activity of recombinant human cystatin C using random-centroid optimization［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2002，1599（1/2）：115-124.

［22］T Dias，MR Bronze，P J Houghton，et al.The flavonoid rich fraction of Coreopsis tinctoria promotes glucose tolerance regain through pancreatic function recovery in streptozotocin induced glucose intolerant rats［J］.Journal of Ethnopharmacology，2010，132：483-490.

Random centroid optimization of flavonoids extraction from Pierman pomegranate

MENG Xin-tao，PAN Yan，XU Ming-qiang，MA Xiao-wen，LI De-hua，XUE Su-lin，ZHANG Ping*
（Research Institute of Agricultural Products Storage and Processing，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi 830091，China）

This research regarded quercetin as contrast caliber，determine content of total flavonoids in pomegranate husk in Pierman by spectrophotometry.Random-centroid optimization（RCO）methodology was used to optimize the ultrasonic extraction technology.Four factors，including ethanol concentration，liquid solid ration，temperature，extraction times were investigated.The optimum extraction process of flavonoids from pomegranate by RCO had been established as follows:ethanol concentration 87%，extraction time 37 min，the extraction temperature 59℃，solid-liquid ratio 1∶24（g/mL）.The yield of flavonoids was 25.56%.Extraction yield of the total flavonoids of pomegranate husk had a downward trend，with the increase of extraction temperature and ethanol concentration，this was showed that the polarity was larger of flavonoids from pomegranate husk.When the total flavonoids concentration was 12 mg/mL，its ability of scavenging the hydroxyl radical reached the highest，and the clearance rate was 91.6%.

Pierman pomegranate；random-centroid optimization；ultrasonic extraction；flavonoids；antioxidadve activity

TS255.1

B

1002-0306（2016）02-0276-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.047

2015－07－02

孟新涛（1985-），女，硕士研究生，助理研究员，研究方向：农产品贮藏加工与保鲜，E-mail：mengxintao_929@126.com。

*通讯作者：张平（1964-），男，博士，研究员，主要从事果树栽培、葡萄酒方面的研究，E-mail：zhangpingyys@163.com。

新疆农业科学院青年基金项目（xjnkq-2015038）。