晋西北酸粥发酵过程中微生物基因组DNA提取方法的比较

常 健，王 琪（山西大学生命科学学院，山西太原030006）

晋西北酸粥发酵过程中微生物基因组DNA提取方法的比较

常 健，王 琪*
（山西大学生命科学学院，山西太原030006）

为了找到一种简单高效的晋西北酸粥发酵过程中微生物基因组DNA提取方法，本文采取对提取的微生物基因组DNA进行浓度测定的方法，比较了溶菌酶-SDS-蛋白酶K法、改良CTAB法和改良CTAB-溶菌酶法三种方法的提取效果。结果表明：溶菌酶-SDS-蛋白酶K法效果最好，可以获得质量较高的微生物基因组DNA，DNA浓度为1657.53 ng/μL；改良CTAB-溶菌酶法比溶菌酶-SDS-蛋白酶K法效果差，DNA浓度为1308.08 ng/μL；改良CTAB法对微生物基因组DNA的提取效果比溶菌酶-SDS-蛋白酶K法更差，DNA浓度为1098.36 ng/μL。以提取到的微生物基因组总DNA为模板，进行16S rDNA基因的PCR扩增，在回收产物中目的条带清晰，表明提取到的微生物基因组DNA含量高、结构完整。整体实验结果表明，溶菌酶-SDS-蛋白酶K法对于提取晋西北酸粥发酵过程中微生物基因组DNA效果最好。

晋西北酸粥，微生物基因组DNA，提取方法

目前提取微生物基因组DNA的方法有很多，例如：物理法（液氮研磨、超声、冻融、颗粒破碎等）［1］、化学法（SDS法、CTAB法、螯合树脂法等）、酶解法（溶菌酶法、蛋白酶K法等）以及它们的相互组合等方法［2］。相对于物理法而言，条件剧烈，大多为需要研磨来破碎细胞［3-4］，同时容易由于机械剪切力而打断基因组DNA，化学法中普遍使用的是SDS法、CTAB法，因其成本低、见效快、效果好而使用广泛。酶解法因条件温和，提取效果好也被广泛应用于微生物基因组DNA的提取中。而对于酸粥微生物基因组DNA的提取还鲜见报道。

由于研究对象和研究目的不同，国内外对于微生物基因组DNA的提取方法各异，针对不同方法提取的微生物基因组DNA而言，提取DNA的纯度及结构完整性是进行基因工程各项研究所必需的条件［5］。

酸粥是我国西北地区传统的谷物发酵食品，主要食用地区分布在内蒙古西部、晋西北、陕西北部等地［6］，是一种典型的地方特色食品，具有口感顺滑、气味酸香、余味绵长、生津止渴等特点。晋西北酸粥是多菌种混合发酵谷物的产物，为了解晋西北酸粥中所含有的微生物种类，可以采用传统培养法和基于分子生物学的免培养法来进行深入研究。文献指出，传统的研究方法是通过纯培养获得菌株后才能对其特性进行描述，然而在自然环境中有相当多的菌种（90%～99%）无法通过传统培养的方法培养出来［7-8］。随着研究的不断深入，可以借鉴分子生物学的方法来克服传统培养方法的不足，可以更加全面地对环境微生物多样性加以探索［9］。而高效的微生物基因组DNA提取方法是对微生物多样性进行研究的重要条件。不同方法对微生物基因组DNA提取效果不同，单一提取方法得到的基因组DNA可能不全面，所以一般多采用几种方法混合使用。

针对不同的材料可以采用不同的方法，在植物基因组DNA提取中，多采用物理法和化学法相结合［10］，也有多种化学法与物理法共同使用的例子［11-13］；在土壤微生物基因组DNA提取中，多有研磨步骤［14］。在晋西北酸粥这一谷物发酵产物中，其粘稠度的产生可能是由于产物中多糖含量较高的缘故，因此，在提取其微生物基因组DNA时，不得不考虑多糖对提取效果的影响［11-12］，综合多种基因组DNA提取方法，最终选定了溶菌酶-SDS-蛋白酶K法、改良CTAB法、改良CTAB-溶菌酶法三种方法，对晋西北酸粥微生物基因组DNA提取效果进行比较，确定最佳的提取方法。

国内外对谷物发酵过程中微生物的数量和菌相进行了一些研究［15-16］。内蒙古酸粥中的微生物不仅包含乳酸菌，还有酵母菌、霉菌［17-18］等。但是对晋西北酸粥的研究还未见报道。因此本文比较了3种提取方法（溶菌酶-SDS-蛋白酶K法、改良CTAB法以及改良CTAB-溶菌酶）对晋西北酸粥中的微生物基因组DNA提取效果，旨在找到一种高效的提取方法来获得高质量的基因组DNA，为下一步研究晋西北酸粥中的微生物类群奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

晋西北酸粥发酵原液 从忻州本地获得；Sodium-Chloride-Tris-EDTA Buffer（STE）（20 mL） NaCl 0.12 g，20 mmol/L Tris-Cl（pH8.0）10 mL，0.5 mol/L（w/v）EDTA 40 μL，ddH2O 9.96 mL；裂解缓冲液（20 mL）20 mmol/L Tris-Cl（pH8.0）10 mL，NaCl 0.12 g，0.5 mol/L （w/v）EDTA 400 μL，ddH2O 9.96 mL，121℃灭菌20 min，灭菌后加入溶菌酶200 mg；2×CTAB 2%CTAB（w/v），1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L EDTA（pH8.0），121℃灭菌20 min；10%SDS（十二烷基硫酸钠）、蛋白酶-K （10 mg/mL） 购自生工生物工程（上海）股份有限公司；Tris-饱和酚 北京博奥拓达科技有限公司；TE 10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0），121℃灭菌20 min；50×TAE（1 L） 准确称取Tris 242 g，EDTA 37.2 g于1 L烧杯中加入800 mL去离子水，充分搅拌溶解，加57.1 mL冰乙酸，充分溶解，最后加去离子水定容至1 L，室温保存；1×TAE 取50×TAE母液20 mL定容至1 L，室温保存；Mr中科瑞泰（北京）生物科技有限公司。

试管恒温加热仪 北京来亨科贸有限责任公司；电热恒温水浴锅 北京市医疗设备总厂；5417R型高速冷冻离心机 德国艾本德股份公司；DYY-6C型电泳仪 北京六一仪器厂；Gel Doc 2000 UV凝胶成像系统、ALS 1296 PCR仪 美国伯乐公司；酶标仪 美国伯腾仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶菌酶-SDS-蛋白酶-K法［19］取酸粥发酵原液9 mL，每1 mL置于1支1.5 mL无菌离心管中，12000 r/min离心10 min，弃上清，用STE缓冲液洗菌两次，取沉淀。将每三支离心管中的沉淀富集于一支无菌离心管中，得到三支含有3 mL菌液中菌体沉淀的离心管，标号E1、E2和E3，用400 μL裂解液吹匀，37℃水浴裂解18 h（每隔1 h混匀一次）。裂解结束后加入45 μL 10%SDS，4.5 μL蛋白酶-K，55℃水浴1 h，每隔10 min上下混匀一次。在离心管中加入Tris-饱和酚、氯仿各225 μL进行抽提，上下缓慢摇晃多次，12000 r/min离心10 min，吸上清至无菌离心管中，用与无菌离心管中液体等体积的氯仿抽提，上下缓慢摇晃多次之后，12000 r/min离心10 min，将所得上清液吸出置于新的无菌离心管中，加入2倍体积的异丙醇，上下轻轻振荡，可见白色絮状沉淀析出。将沉淀用1 mL 75%乙醇洗涤2次，风干后溶于100 μL TE，60℃水浴1 h，4℃、12 h溶解。

1.2.2 改良CTAB法 根据张晓祥等［20］的CTAB法进行改良。取酸粥发酵原液9 mL，每1 mL置于1支1.5 mL无菌离心管中，12000 r/min离心10 min，弃上清，用STE洗菌两次，取沉淀。将每三支离心管中的沉淀富集于一支无菌离心管中，得到三支含有3 mL菌液中菌体沉淀的离心管，标号C1、C2和C3，分别加入经65℃预热的300 μL 2×CTAB提取缓冲液，加2%β-巯基乙醇（1 mL 2×CTAB提取缓冲液中加2 μL），65℃水浴中轻轻混匀［11-12］，加400 μL 10%SDS，10 μL 10 mg/mL蛋白酶-K，混匀，置于65℃水浴1 h，每隔10 min上下摇晃混匀，冷却至室温。在离心管中加入Tris-饱和酚、氯仿各355 μL进行抽提，上下缓慢摇晃多次，12000 r/min离心10 min，吸上清至无菌离心管中，用与无菌离心管中液体等体积的氯仿抽提，上下缓慢摇晃多次之后，12000 r/min离心10 min，将所得上清液吸出置于新的无菌离心管中，加入2倍体积的异丙醇，上下轻轻振荡，可见白色絮状沉淀析出。将沉淀用1 mL 75%乙醇洗涤2次，风干后溶于100 μL TE，60℃水浴1 h，4℃、12 h溶解。

1.2.3 改良CTAB-溶菌酶法 根据张晓祥等［20］的CTAB法进行改良。取酸粥发酵原液9 mL，每1 mL置于1支1.5 mL无菌离心管中，12000 r/min离心10 min，弃上清，用STE洗菌两次，取沉淀。将每三支离心管中的沉淀富集于一支无菌离心管中，得到三支含有3 mL菌液中菌体沉淀的离心管，标号L1、L2和L3，分别加入经65℃预热的300 μL 2×CTAB提取缓冲液，加2%β-巯基乙醇（1 mL 2×CTAB提取缓冲液中加2 μL），在65℃水浴中轻轻混匀，加入溶菌酶（100 mg/mL）使其终浓度为10 mg/mL，加400 μL 10%SDS，10 μL 10 mg/mL蛋白酶-K，65℃水浴1 h，每隔10 min混匀。在离心管中加入Tris-饱和酚、氯仿各360 μL进行抽提，上下缓慢摇晃多次，12000 r/min离心10 min，吸上清至无菌离心管中，用与无菌离心管中液体等体积的氯仿抽提，上下缓慢摇晃多次之后，12000 r/min离心10 min，将所得上清液吸出置于新的无菌离心管中，加入2倍体积的异丙醇，上下轻轻振荡，可见白色絮状沉淀析出。将沉淀用1 mL 75%乙醇洗涤2次，风干后溶于100 μL TE，60℃水浴1 h，4℃、12 h溶解。

1.2.4 酶标仪测DNA浓度 取对照液TE 2 μL，4℃、12 h溶解后的DNA样品2 μL，点样于酶标仪点样孔，测定所提取得到的微生物基因组DNA在260 nm和280 nm处吸光度值，以及在260 nm和280 nm处的比值，测得微生物基因组DNA的浓度，实验重复3次。

1.2.5 电泳 将提取到的DNA样品，经0.6%琼脂糖凝胶电泳，Mr为λDNA/HindⅢ，Mr上样2 μL，DNA样品2 μL加1 μL 6×DNA Loading Buffer，电泳结果UV凝胶成像系统进行检测。

1.2.6 提取到的DNA样品PCR及产物回收 将提取得到的微生物基因组DNA进行PCR，方法如下。

反应体系（50 μL）：10×Trans Easy Taq Buffer，5 μL；dNTP，2 μL；引物（20 μmol/L）各5 μL；Trans Easy Taq DNA polymerase，1 μL；DNA模板，1 μL；ddH2O补至50 μL。各试剂加好后，轻轻混匀。阴性对照不加模板。

反应条件为：预变性94℃、5 min；变性94℃、30 s；退火55℃、30 s；延伸72℃、90 s；35个循环后，72℃保温10 min。

扩增产物和回收产物均经0.6%的琼脂糖凝胶电泳分离，UV凝胶成像系统检测。

1.3 统计学分析

实验设3次重复，实验结果用SPSS软件（版本18.0）Duncan多重比较法［21］进行多个均数间的差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 晋西北酸粥微生物基因组DNA浓度比较

由图1可知，溶菌酶-SDS-蛋白酶-K法所得离心管中DNA浓度为（1657.53±136.65）ng/μL。改良CTAB法所得离心管中DNA浓度为（1098.36±49.18）ng/μL。改良CTAB-溶菌酶法所得离心管中DNA浓度为（1308.08±55.38）ng/μL。溶菌酶-SDS-蛋白酶-K法提取所得的微生物基因组DNA浓度最高，改良CTAB-溶菌酶法次之，改良CTAB法最少。三种方法提取所得的微生物基因组DNA浓度之间存在显著差异（p＜0.05）。

溶菌酶-SDS-蛋白酶K法，反应条件比较温和，需要时间较长，主要原因是酸粥这种谷物发酵产品中的微生物种类多、天然成分多，所以较长的裂解有利于基因组的提取，裂解时间约为18 h。沉淀基因组时加入75%的乙醇后，得到的是较为致密的DNA。TE溶解后DNA浓度高；改良CTAB法，试剂作用强烈，在短时间内迅速裂解细胞，释放出DNA，可能会对微生物基因组DNA造成损伤。提取到的DNA先呈松散絮状，在不断晃动过程中逐渐致密，TE溶解后DNA浓度较溶菌酶-SDS-蛋白酶K法少，实验中所用到的β-巯基乙醇，刺激性强，有一定的毒性；改良CTAB-溶菌酶法，在改良CTAB法的基础上，又加入了溶菌酶，希望在溶菌酶的作用下，可以更快地裂解细胞。但经TE溶解后DNA浓度仍低于溶菌酶-SDS-蛋白酶K法，整个实验中所用到的β-巯基乙醇，刺激性强，有一定的毒性。提取时间也没有缩短，反而消耗了大量试剂。

图1 酶标仪测定微生物基因组浓度Fig.1 Microbial genomic concentrations determined by microplate reader

2.2 晋西北酸粥微生物基因组DNA ABS260 nm/ ABS280 nm的结果比较

由图2可知，溶菌酶-SDS-蛋白酶-K法所得DNA 的ABS260 nm/ABS280 nm为1.95±0.01。改良CTAB法所得DNA的ABS260 nm/ABS280 nm为1.92±0.03。改良CTAB-溶菌酶法所得DNA的ABS260 nm/ABS280 nm为1.94±0.03。结果表明3种方法提取得到的微生物基因组DNA纯度高，所得到的微生物基因组DNA中蛋白质以及RNA含量低，ABS260 nm/ABS280 nm均在1.8～2.0之间，可用于进行后续相关研究。三种方法提取所得的微生物基因组DNA浓度之间存在显著差异（p＜0.05）。

图2 酶标仪测定微生物基因组DNA ABS260 nm/ABS280 nm的比值Fig.2 The ratio of microbial genome DNA ABS260 nm/ABS280 nmdetermined by microplate reader

2.3 晋西北酸粥微生物基因组DNA样品电泳检测结果比较

由图3可以看出，上述3种方法均可以提取到酸粥微生物完整的基因组DNA，大小约为23 ku，条带较单一，未见明显降解现象。溶菌酶-SDS-蛋白酶-K法DNA最亮，点样孔处无蛋白质残留，改良CTAB 法DNA亮度最低，点样孔处有少量蛋白质残留，改良CTAB-溶菌酶法DNA较亮，但比溶菌酶-SDS-蛋白酶-K法所得DNA亮度低，点样孔处有少量蛋白质残留。

图3 3种方法提取的DNA琼脂糖凝胶电泳图Fig.3 Agarose gel electrophoresis of DNA extracted by 3 methods

2.4 晋西北酸粥微生物基因组DNA样品PCR结果比较

由图4可知，不论是溶菌酶-SDS-蛋白酶-K法、改良CTAB法还是改良CTAB-溶菌酶法提取的DNA均可直接用于PCR，其PCR产物凝胶电泳结果均很亮，杂带与目的条带有一较为明显的分界，阴性对照中无目的条带。

图4 3种方法提取的DNA PCR产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR products ofDNA extracted by 3 methods

2.5 晋西北酸粥微生物基因组DNA样品PCR产物胶回收结果比较

由图5可知，溶菌酶-SDS-蛋白酶-K法、改良CTAB法、改良CTAB-溶菌酶法提取得到的DNA PCR产物胶回收后凝胶电泳条带单一，亮度高，证明所提取的微生物基因组DNA中含有所需要的目的片段。

3 结论

溶菌酶-SDS-蛋白酶K法、改良CTAB法、改良CTAB-溶菌酶法这三种方法提取所得DNA浓度的平均值依次为1657.53、1098.36、1308.08 ng/μL，同时，三种方法得到DNA的ABS260 nm/ABS280 nm平均值依次为1.95、1.92、1.94，都表明本文中所使用的三种方法都可以得到质量较高的酸粥微生物基因组DNA。但溶菌酶-SDS-蛋白酶K法实验刺激性弱、安全系数高，可以得到较高含量的微生物基因组DNA，所得微生物基因组DNA对后续实验有较大帮助；改良CTAB法虽然时间短，但是有刺激性气味和一定的毒性，所得DNA浓度也较低；改良CTAB-溶菌酶法时间短，但与改良CTAB法效果相似，且耗费试剂多。所以，溶菌酶-SDS-蛋白酶K法对于提取晋西北酸粥发酵过程中微生物基因组DNA效果最好。

图5 3种方法提取的DNA PCR产物胶回收琼脂糖凝胶电泳图Fig.5 Agarose gel electrophoresis of PCR products recovery of DNA extracted by 3 methods

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Comparison of microbial genome DNA extraction methods used in the fermentation process of northwestern Shanxi acid gruel

CHANG Jian，WANG Qi*
（School of Life Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

In order to obtain a simple and efficient extraction method of microbial genome DNA from northwestern Shanxi acid gruel，three extraction methods（lysozyme-SDS-proteinase K method，improved CTAB method and improved CTAB-lysozyme method）were compared according to the concentrations of extracted microbial genome DNA.The results showed that the effect of the lysozyme-SDS-proteinase K method was the best，flowed by improved CTAB-lysozyme method and improved CTAB method.By lysozyme-SDS-proteinase K method，higher quality of microbial DNA could be obtained and the DNA concentration was 1657.53 ng/μL.When using the improved CTAB-lysozyme method and improved CTAB method，the DNA concentrations were respectively 1308.08 ng/μL and 1098.36 ng/μL.The total DNA of 16S rDNA gene PCR amplification was tested.The results showed that the purpose stripe was clear in recycling products，which indicated that the microbial genome DNA obtained in this experiment had high content and complete structure.All the results showed that the lysozyme-SDS-proteinase K method was the best to extract the microbial genome DNA of northwestern Shanxi acid gruel.

northwestern Shanxi acid gruel；microbial genome DNA；extraction method

TS201.3

A

1002-0306（2016）02-0209-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.034

2015－06－30

常健（1990-），男，硕士研究生，研究方向：资源微生物，E-mail：yizizhan151@163.com。

*通讯作者：王琪（1982-），女，博士，讲师，研究方向：资源微生物，E-mail：wangqi@sxu.edu.cn。