液相色谱法测定苄嘧磺隆和仲丁灵在水稻中的贮存稳定性

谷　岩,　梁　爽,　侯志广,　赵晓峰,　王鑫宏,　逯忠斌

(吉林农业大学资源与环境学院,长春　130118)



液相色谱法测定苄嘧磺隆和仲丁灵在水稻中的贮存稳定性

谷岩,梁爽,侯志广,赵晓峰,王鑫宏,逯忠斌*

(吉林农业大学资源与环境学院,长春130118)

建立了苄嘧磺隆和仲丁灵在水稻样品中残留的高效液相色谱分析方法,并研究了二者在水稻样品中的贮存稳定性。贮存在-18℃和-20℃下水稻样品经提取净化后,采用高效液相色谱仪-紫外检测器,在240 nm波长下对试样中的苄嘧磺隆和仲丁灵进行分离和定量分析。结果表明,苄嘧磺隆和仲丁灵的峰响应面积与进样浓度呈现良好的线性关系,其相关系数分别为0.999 7和0.999 9。苄嘧磺隆的相对标准偏差为0.5%～12.0%,回收率为77.2%～104.6%。仲丁灵的相对标准偏差为0.8%～7.6%,回收率为73.0%～106.4%。苄嘧磺隆和仲丁灵在水稻5种基质中贮存90 d后分解率小于5%,符合FAO/WHO联合标准的等同认定要求。苄嘧磺隆和仲丁灵具有良好的稳定性。

苄嘧磺隆;仲丁灵;水稻;高效液相色谱法;贮存稳定性

苄嘧磺隆(bensulfuron-methyl,BSM)属磺酰脲类除草剂,主要用于水稻田防除一年生和部分多年生阔叶杂草和莎草科杂草[1-3]。仲丁灵(butralin)属于二硝基苯胺类芽前除草剂[4-5],对一年生禾本科杂草及部分阔叶杂草具有良好的防效[6]。二者复配可扩大杀草范围,增强防治效果。对于二者的残留分析方法，已报道的主要有高效液相色谱法[7-9]和气相色谱法[10-11]等。而采用高效液相色谱同时分析苄嘧磺隆和仲丁灵的方法目前尚未见报道。在水稻样品贮存过程中,目标农药稳定与否直接关系到试验数据的可靠性[12],因此,明确不同农药在基质中的最佳贮存条件和贮存时间非常重要,从而保证被分析农药在贮存时期内未发生变化。EPA[13]、OECD[14]和FAO[15]的准则中对农药残留的贮存稳定性试验做了要求与规定,残留试验样品应该在采样或收获24 h内冷冻贮存。研究表明，农药在低温冷冻条件下贮存通常会更稳定[16-19]。故本文选择常用低温冷冻温度-18℃和-20℃,研究了苄嘧磺隆和仲丁灵在水稻样品中的贮存稳定性,并建立了两者的高效液相色谱分析方法。

1　试验材料与方法

1.1主要仪器和试剂

Agilent1200高效液相色谱仪(配紫外检测器);Thermo-BDS Hypersil C18色谱柱(5 μm,250 mm×4.6 mm);水浴恒温振荡器;超声波清洗器;植物粉碎机;高速搅拌器;旋转蒸发仪;减压抽滤器;层析柱等玻璃器皿。

苄嘧磺隆标准品(质量分数为97.5%),仲丁灵标准品(质量分数为99.5%),由德国Dr. Ehrenstorfer Gmbh公司提供;32%苄嘧磺隆·仲丁灵可湿性粉剂(有效成分含量:2%苄嘧磺隆,30%仲丁灵),由江苏省苏州市宝带农药提供。其他试剂包括：乙腈(色谱纯);水(二次蒸馏水);冰乙酸,甲醇,二氯甲烷,乙酸乙酯(均为分析纯);中性氧化铝和弗罗里硅土。

1.2色谱条件

流动相为乙腈-0.1%冰乙酸。

土壤、稻田水、稻壳、植株提取样品梯度洗脱条件：0～6 min，保持55%乙腈；7～20 min，保持80%乙腈；21 ～33 min，保持55%乙腈。保留时间：苄嘧磺隆为6.3～6.5 min；仲丁灵为16.8～17.0 min。

糙米提取样品梯度洗脱条件：0～13 min，保持58%乙腈；13～21.5 min，保持79%乙腈；22～35 min，保持58%乙腈。保留时间：苄嘧磺隆为5.6～5.8 min；仲丁灵为17.6～17.8 min。

土壤、稻田水、稻壳、植株提取样品梯度洗脱条件:0～6 min,保持55%乙腈；7～20 min,保持80%乙腈；21～33 min,保持55%乙腈。保留时间:苄嘧磺隆为6.3～6.5 min；仲丁灵为16.8～17.0 min。

糙米提取样品梯度洗脱条件:0～13 min,保持58%乙腈；13～21.5 min,保持79%乙腈；22～35 min,保持58%乙腈。保留时间:苄嘧磺隆为5.6～5.8 min；仲丁灵为17.6～17.8 min。

1.3标准曲线的绘制

分别称取苄嘧磺隆标准品0.0102 g、仲丁灵标准品0.010 0 g(均精确至0.000 2 g),分别置于10 mL容量瓶中,甲醇定容配制成标准母液,分别稀释成0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L共5个不同质量浓度的标准溶液,摇匀,按照1.2给出的色谱条件进行测定,以进样浓度x为横坐标,以对应的色谱峰响应面积值y为纵坐标,进行线性回归,得到标准曲线。

1.4样品前处理

1.4.1样品的提取

稻田土壤、糙米、稻壳:称取土壤50.0 g,糙米20.0 g,稻壳10.0 g,于具塞三角瓶中,加入80 mL乙腈和10 mL水,恒温水浴振荡1 h,在辅有助滤剂的布氏漏斗中减压抽滤,收集滤液,置于装有7 g氯化钠的具塞量筒中上下振荡150次,静置1 min,再上下振荡100次,静置1 h,取40 mL上清液浓缩后待净化。

水稻植株:称取植株20.0 g,加入80 mL乙腈,组织捣碎后,在辅有助滤剂的布氏漏斗中减压抽滤,收集滤液,置于装有7 g氯化钠的具塞量筒中上下振荡150次,静置1 min,再上下振荡100次,静置1 h,取40 mL上清液浓缩后待净化。

稻田水:量取50 mL稻田水,置于250 mL分液漏斗中,加入1 mol/L盐酸溶液,pH调至2～3,乙酸乙酯(40、40、40 mL)萃取3次,过装有适量无水硫酸钠的漏斗后,用平底烧瓶收集滤液,用旋转蒸发器在40℃下减压浓缩至近干,氮气吹干后,5 mL甲醇定容,过0.22 μm滤膜,待液相色谱测定。

1.4.2柱层析净化

装柱：用于净化土壤、糙米、稻壳提取物的层析柱从下至上依次为2 cm无水硫酸钠、2 g弗罗里硅土和2 cm无水硫酸钠;用于净化植株提取物的层析柱从下至上依次为2 cm无水硫酸钠、3 g中性氧化铝和2 cm无水硫酸钠。

净化：将土壤、植株、稻米和稻壳提取后浓缩的样品转移至层析柱中,先用20 mL二氯甲烷/甲醇=7/3(V/V)预淋洗,再用100 mL二氯甲烷/甲醇=7/3(V/V)洗脱,洗脱液置于旋转蒸发器中在40℃下减压浓缩至近干,随后用氮气吹干。净化后的土壤样品用5 mL甲醇定容;植株、糙米、稻壳样品用2 mL甲醇定容,用0.22 μm滤膜除菌,待液相色谱测定。

1.5方法的准确度和精密度

用未施用过苄嘧磺隆和仲丁灵的稻田水、土壤、植株、稻壳和糙米样品(空白对照)分别进行3个添加水平(0.05、0.5、1.0 mg/L)的添加回收试验,每个水平重复5次。按照上述样品前处理方法和色谱条件测定方法回收率。

1.6贮存稳定性试验

32%苄嘧磺隆·仲丁灵可湿性粉剂的田间试验施药浓度通常为低剂量(推荐剂量)和高剂量(1.5倍推荐剂量,有效成分504 g/hm2),本试验在室内模拟田间试验,浓度设置为有效成分2 520 g/hm2(高剂量的5倍)。

分别称取稻田土壤空白样品5.0 kg、稻田水空白样品3.0 L、植株空白样品 2.0 kg、糙米空白样品2.0 kg、稻壳空白样品1.0 kg置于不同容器内,再分别称取0.052 5、0.030 5、0.020 6、0.020 6和0.010 3 g 32%苄嘧磺隆·仲丁灵可湿性粉剂,兑水溶解后均匀喷施于土壤、稻田水、植株、糙米和稻壳样品中,混匀,置于-18℃和-20℃冰箱内保存(使用温度记录仪观察温度变化)。每个样品的每个温度处理设3次重复。在施药后 0.5 h、7、15、30、60、90 d采集样品,检测样品中苄嘧磺隆和仲丁灵的浓度变化。

2　结果与分析

2.1色谱条件的选择

为了能使苄嘧磺隆和仲丁灵与杂质有效分离,先后试验了甲醇-水,乙腈-水,乙腈-0.1%冰乙酸的流动相对两种除草剂的峰形、分离度、出峰时间,最终选择乙腈-0.1%冰乙酸,并根据样品基质不同设置梯度洗脱,使苄嘧磺隆和仲丁灵有较好的分离效果,峰形对称,保留时间适中,可以满足分析要求。

2.2检测波长的确定

苄嘧磺隆的最大吸收在238 nm处,仲丁灵的最大吸收在240 nm处,综合样品中2个有效成分的含量,确定240 nm为最佳检测波长。

2.3方法的线性关系

结果表明,苄嘧磺隆和仲丁灵峰响应面积值y与进样浓度x有着良好的线性关系,线性回归方程为：苄嘧磺隆y=26.873x+0.797 7,相关系数为0.999 7;仲丁灵y=113.42x+1.018 8,相关系数为0.999 9。(图1)

图1　苄嘧磺隆和仲丁灵的标准曲线Fig.1　Standard curve of bensulfuron-methyl and butralin

2.4方法精密度和准确度

在选定的色谱条件下,以3倍信噪比计算得苄嘧磺隆和仲丁灵的方法最小检出量(LOD)为0.310 ng和0.057 ng,最低检测浓度均为0.100 mg/L。不同方法添加回收试验结果见图2和表1。由表可知:在3个不同质量分数添加水平下,平均回收率为73.0%～106.4%;相对标准偏差为0.5%～12.0%,分析结果符合农药残留量分析与检测技术的要求。

图2　水稻土壤中的苄嘧磺隆和仲丁灵的色谱图(苄嘧磺隆:6.3～6.5 min,仲丁灵:16.8～17.0 min)Fig.2　Chromatograms of two pesticides in paddy soil (bensulfuron-methyl:6.3～6.5 min,butralin:16.8～17.0 min)

2.5贮存稳定性

苄嘧磺隆和仲丁灵在水稻土壤、稻田水、植株、糙米和稻壳中的残留量与施药后的取样时间之间的稳定性见图3,由图3可知,水稻残留样品中苄嘧磺隆和仲丁灵的残留量随贮存时间无明显变化,-18℃与-20℃差异不显著,经数据分析得出两者在此条件下贮存,分解率均小于5%,符合FAO/WHO联合标准的等同认定要求。由此证明,两者在低温冷冻贮存过程中稳定性良好。

表1　苄嘧磺隆和仲丁灵在不同水稻样品中的添加回收率(n=5)Table 1　Recoveries of bensulfuron-methyl and butralin in different matrix(n=5)

图3　苄嘧磺隆和仲丁灵的贮存稳定性Fig.3　Storage stability of bensulfuron-methyl and butralin

3　结论与讨论

本文建立了高效液相色谱同时测定水稻样品中苄嘧磺隆和仲丁灵两种药物残留的分析方法。根据相似相溶原理,采用甲醇、二氯甲烷、乙腈、丙酮和乙酸乙酯的溶液作为水稻样品的提取液,结果发现,二氯甲烷提取土壤样品时,会出现土壤凝结现象,提取效果不好。丙酮提取植株后叶绿素等杂质峰较多。甲醇和乙酸乙酯做提取溶剂时添加回收率较乙腈低,故最终选择乙腈作为提取溶剂。分别采用上述溶剂的混合溶液作为水稻样品的淋洗液,当选用二氯甲烷/甲醇=7/3(V/V)时,提取效果好,回收率较高,较稳定。由于植株中色素等杂质较多,而中性氧化铝对于色素的吸附优于弗罗里硅土,且该方法回收率达到农药残留检测要求,故选择中性氧化铝柱层析净化植株样品。

其次,比较了-18℃和-20℃下苄嘧磺隆和仲丁灵在水稻样品中的贮存稳定性,样品贮存90 d后农药稳定性好,分解率均小于5%,两个温度差异不显著,符合FAO/WHO联合标准的等同认定要求。

综上所述,本方法前处理简便快速、净化效果好,苄嘧磺隆和仲丁灵在相应的浓度范围内线性良好、检测灵敏可靠,水稻样品中的苄嘧磺隆和仲丁灵在低温(-18℃和-20℃)冷冻条件下贮存稳定性良好。

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(责任编辑：杨明丽)

Storage stability of bensulfuron-methyl and butralin in rice samples using HPLC

Gu Yan,Liang Shuang,Hou Zhiguang,Zhao Xiaofeng,Wang Xinhong,Lu Zhongbin

(College of Resource and Environment, Jilin Agricultural University, Changchun130118, China)

A method has been developed for determining bensulfuron-methyl and butralin residues in rice samples by high performance chromatography (HPLC), and the storage stability of different test samples under different conditions (-18℃ and -20℃) were also investigated. The results showed that the peak area of bensulfuron-methyl and butralin are positively correlated to their concentration with correlation coefficients of 0.999 7 and 0.999 9, respectively. The relative standard deviations for bensulfuron-methyl detection were 0.5%-12.0%, and the average recovery rates were 77.2%—104.6%. The relative standard deviations for butralin detection were 0.8%—7.6%, and the average recovery rates were 73.0%—106.4%. Both bensulfuron-methyl and butralin had good storage stability and their degradation rates were both less than 5% in rice matrix during 90 days storage period.

bensulfuron-methyl;butralin;rice;HPLC;storage stability

2014-11-27

2015-02-03

农业部农药残留试验项目(2014NCJ09)

E-mail:luzong1979@aliyun.com

S 451.2

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.028