应用RT-PCR和dot-ELISA方法检测单头灰飞虱体内水稻条纹病毒

张水英,　蒋春和,　兰平秀,3,　张雪峰,　李　凡*

(1. 云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室,昆明　650201; 2. 云南农业大学教务处,昆明　650201; 3. 云南农业大学动物科学技术学院, 昆明　650201; 4. 红河学院,蒙自　661199)



应用RT-PCR和dot-ELISA方法检测单头灰飞虱体内水稻条纹病毒

张水英1,蒋春和2,兰平秀1,3,张雪峰4*,李凡1*

(1. 云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室,昆明650201; 2. 云南农业大学教务处,昆明650201; 3. 云南农业大学动物科学技术学院, 昆明650201; 4. 红河学院,蒙自661199)

本文比较了RT-PCR和dot-ELISA两种方法对单头灰飞虱携带水稻条纹病毒(Ricestripevirus,RSV)的检出率、检测灵敏度和检测成本。结果表明,两种方法均能检测到单头灰飞虱体内的RSV,RT-PCR检测单头灰飞虱体内RSV的阳性检出率比dot-ELISA方法低11.79%～15.77%,但RT-PCR的检测灵敏度比dot-ELISA高10倍,RT-PCR技术的检测成本比dot-ELISA的高。结果暗示,对于单头介体昆虫中的病毒检测,RT-PCR技术的检出率不一定比dot-ELISA的高。综合考虑后,如对室外大批量灰飞虱进行带毒率检测时可采用dot-ELISA方法,如需准确分析单头灰飞虱体内RSV时可采用RT-PCR方法。

水稻条纹病毒;灰飞虱;RT-PCR;dot-ELISA;检测

水稻条纹病毒(Ricestripevirus,RSV)引起水稻条纹叶枯病,自然界中可以由灰飞虱(Laodelphaxstriatellus)、白脊飞虱(Unkanodessapporona)、白带飞虱(U.albifascia)和白条飞虱(Terthronalbovittatum)传播,但主要依靠灰飞虱以持久方式经卵传给后代[1]。水稻是RSV最主要的寄主,受侵染的水稻最典型的外部症状为出现褪绿的条纹斑点或斑块,一般最早出现在嫩叶,根据具体表现症状可以分为卷叶型和展叶型两类。水稻条纹叶枯病最早于1897年在日本关东地区发生,随后在俄罗斯、朝鲜、韩国、前苏联和乌克兰相继发生[2]。我国自1963年首次在江苏南部地区发生后,该病迅速扩及到18个省(市、自治区)的广大稻区,并在江苏、安徽、河南、山东、云南、北京、上海、台湾等地暴发流行,病情严重的稻区甚至颗粒无收。自2006年以来，通过选育抗病品种、加强病害的预测预报、合理用药等综合治理措施,该病害发生面积已大幅下降[3],但是全国各地仍时有发生,因此对该病进行早期预测预报及有效防控仍很有必要。

灰飞虱的带毒率与水稻条纹叶枯病的发生关系密切,快速、准确地检测灰飞虱体内的RSV对水稻条纹叶枯病的预测预报和防治具有重要意义。要准确探明田间灰飞虱的带毒率,需要对大量单头灰飞虱携带RSV情况进行检测。RSV的检测方法有许多,包括 ELISA、DIBA、Western Blot、RT-PCR、Northern 杂交等[4-6],其中RT-PCR具有灵敏度高、特异性强、准确性好等特点。dot-ELISA除具有灵敏度高、特异性强等特点外,还具有成本低的优势,适于大批量样品检测,且不需要特殊仪器设备,操作简便,结果判定简单易行,因此被广泛应用于灰飞虱体内RNA病毒的检测[7-9]。虽然目前利用RT-PCR和dot-ELISA检测灰飞虱体内水稻病毒的报道有不少,但尚未见比较这两种方法检测单头灰飞虱体内RSV的相关报道。本文比较了两种方法对单头灰飞虱体内RSV的检出率、检测灵敏度和检测成本等,以期为单头灰飞虱体内RSV以及其他虫传病毒的检测提供参考。

1　材料与方法

1.1试验材料

可能携带水稻条纹病毒的灰飞虱高龄若虫和成虫，在温室用‘武育粳3号’饲养。

1.2试验试剂

0.01 mol/L PBS缓冲液,百泰克公司的TRIpure总RNA提取试剂,TaKaRa公司的 Reverse Transcriptase M-MLV RNase H-反转录试剂盒,Tiangen公司的TaqDNA Polymerase试剂盒,美国KPL公司的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗,Sigma公司的TMB显色液,美国PALL公司的硝酸纤维素滤膜。RSV单克隆抗体由浙江大学周雪平教授惠赠。

1.3试验方法

1.3.1样品准备

在比较两种方法的检出率时,设置了两个处理,处理1:同一头灰飞虱,用PBS研磨后将上清液分成两部分,一部分直接用于dot-ELISA检测,另一部分提RNA后进行RT-PCR检测,该处理设置3组重复,分别检测灰飞虱20、30、20头。处理2:不同的单头灰飞虱分别进行RT-PCR和dot-ELISA检测,均各自设置2组重复,分别检测灰飞虱34、72头。

1.3.2单头灰飞虱体内RSV的RT-PCR检测

根据已报道的RSV RNA4序列,设计特异性RSV检测引物(RNA4dF1:5′-ACACAAAGTCCAGGGCATTT-3′,RNA4dR1:5′-CACACAAGAAGGTCAACCCAAAC-3′)。利用TRIpure试剂提取单头灰飞虱上清液中的总RNA,取1 μL总RNA用ddH2O按100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍进行系列稀释,然后分别按照Reverse Transcriptase M-MLV RNase H-反转录试剂盒和TaqDNA Polymerase试剂盒说明书进行RT-PCR扩增。

1.3.3单头灰飞虱体内RSV的dot-ELISA检测

dot-ELISA采用Xie等[10]的方法,略有改动。取1 μL用0.01 mol/L PBS缓冲液研磨单头灰飞虱后的上清液,用0.01 mol/L PBS进行100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6系列稀释;取2 μL稀释液点到NC膜上,室温干燥;用5%脱脂奶粉室温封闭60 min,用含5%脱脂奶粉的PBST缓冲液按1∶8 000稀释RSV单克隆抗体,将抗体与NC膜在室温孵育60 min;洗膜后与用含5%脱脂奶粉的PBST缓冲液按1∶10 000的比例稀释辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗室温孵育60 min;洗膜后用TMB底物显色液显色,待NC膜上的阳性样品呈现明显蓝色而阴性对照未显色时弃显色液终止反应,记录结果并照相保存。

2　结果与分析

2.1RT-PCR和dot-ELISA方法对单头灰飞虱体内RSV的检出率

处理1中,RT-PCR的RSV平均阳性检出率为55.56%,dot-ELISA的RSV平均阳性检出率为67.35%,RT-PCR的RSV平均阳性检出率比dot-ELISA方法低11.79%。处理2中,RT-PCR和dot-ELISA的RSV平均阳性检出率分别为27.82%和43.59%,前者阳性检出率比后者低15.77%。无论是同一头灰飞虱同时进行RT-PCR检测和dot-ELISA检测,还是不同的单头灰飞虱分别进行dot-ELISA和RT-PCR检测,RT-PCR的RSV阳性检出率都比dot-ELISA的低(表1)。

表1　RT-PCR和dot-ELISA对单头灰飞虱体内RSV的检出率1)Table 1　Detection rate of RSV in individual SBPHs by RT-PCR and dot-ELISA

1) 处理1:随机采集的同一头灰飞虱既进行RT-PCR检测又进行dot-ELISA检测;处理2:随机采集的不同的单头灰飞虱,一半进行RT-PCR检测,另一半进行dot-ELISA检测。

Treatment 1: RSV detection was conducted by both RT-PCR and dot-ELISA for the same individual SBPH; Treatment 2: RSV detection was conducted by RT-PCR or dot-ELISA for different individual SBPHs.

2.2RT-PCR和dot-ELISA对单头灰飞虱体内RSV的检测灵敏度

取一头灰飞虱用PBS缓冲液充分研磨后得到上清液,一部分上清液用PBS按10×梯度进行稀释后用于dot-ELISA检测,稀释倍数为100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6,随着稀释倍数增大,阳性显色逐渐减弱,稀释至10-2后便不再显色(图1),即dot-ELISA方法可以检测到RSV的最大稀释倍数为原液的100倍。另一部分上清液提RNA后用ddH2O 按10×梯度进行稀释后用于RT-PCR检测,稀释倍数为100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6,随着稀释倍数增大,目标条带逐渐减弱,稀释至10-3后便检测不到目标条带(图2),即RT-PCR方法可以检测到RSV的最大稀释倍数为原RNA浓度的1 000倍。

图1　Dot-ELISA对单头灰飞虱体内RSV的检测灵敏度Fig.1　Detection sensitivity for RSV in individual SBPHs by dot-ELISA

2.3RT-PCR和dot-ELISA对单头灰飞虱体内RSV的检测成本比较

对单头灰飞虱进行RT-PCR检测时,如果选用较为便宜的TRIpure总RNA提取试剂、TaKaRa Reverse Transcriptase M-MLV反转录试剂盒和天根TaqDNA Polymerase试剂盒等,折算后检测1个样品的主要试剂、耗材成本约为20～30元;对单头灰飞虱进行dot-ELISA检测时,需用到硝酸纤维素滤膜、RSV单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗和TMB显色液,折算后检测1个样品的试、耗材成本约为8～10元,约是RT-PCR检测成本的1/3。由此可见RT-PCR检测成本比dot-ELISA高许多。

图2　RT-PCR对单头灰飞虱体内RSV的检测灵敏度Fig.2　Detection sensitivity for RSV in individual SBPHs by RT-PCR

3　讨论

刘珊珊等[11]、马占鸿等[12]的研究结果表明RT-PCR检测灵敏度比dot-ELISA的高,因此我们起初也一直认为RT-PCR的检出率应该比dot-ELISA的高,但是经过多次试验,结果都是RT-PCR的阳性检出率比dot-ELISA的低,且存在RT-PCR检测为阳性的样品dot-ELISA检测却为阴性、dot-ELISA检测为阳性的样品RT-PCR检测为阴性的现象。针对RT-PCR和dot-ELISA阳性检出率不一致的现象,我们分别用TRIpure、RNAiso和Trizol 3种RNA提取试剂分别对单头灰飞虱的RNA进行提取,发现3种试剂的提取效果差异不大,结果依然是RT-PCR的阳性检出率比dot-ELISA的低,说明RNA的提取试剂不是造成RT-PCR检出率比dot-ELISA低的主要原因。另外对两种方法检测结果出现双向差异的这些样品进行10、50、100、200倍稀释后再检测,发现结果仍然是RT-PCR的阳性检出率比dot-ELISA的低。于是我们用IC-RT-PCR对这些样品进行验证,结果显示RT-PCR和IC-RT-PCR的检测结果基本一致,且IC-RT-PCR阳性检出率比RT-PCR提高8%左右,依然存在部分阳性结果与dot-ELISA不吻合的现象。

饶黎霞等[13]的研究结果也表明,分别用RT-PCR和dot-ELISA检测水稻上的南方水稻矮缩病毒、水稻矮缩病毒和水稻齿叶矮缩病毒时,从检出率看,两种方法的吻合率并不完全一致,并因病毒而异。另外嵇朝球等[14]、杨杰等[15]认为dot-ELISA是在蛋白质水平上检测有无病毒的外壳蛋白,这种检测法受到基因表达和环境条件等因素的影响,检测结果假阳性较高,导致dot-ELISA的检出率要高许多。另外在开展RT-PCR检测前需要对单头灰飞虱进行RNA提取,因虫体很小,很容易在提取过程中发生RNA的降解及丢失,导致RT-PCR的检出率要低一些,这些可能都是导致在对大批量单头灰飞虱进行检测时很难做到两种方法的检测结果完全吻合的原因。

在使用成本及实用性方面,RT-PCR方法所使用的仪器和试剂成本较高,需要专业人员进行操作,不利于大批量的样品检测。dot-ELISA方法的成本相对较低,灵敏度高、特异性强,不需要特殊仪器设备,适用于大批量的单头灰飞虱样品检测,但可能存在假阳性现象。总的来说在进行田间大批量灰飞虱带毒率的检测时,dot-ELISA方法是一个不错的选择,而需要准确分析单头灰飞虱体内RSV时,选择RT-PCR方法较好,各单位可根据自己的条件及具体情况来选择检测技术[16]。

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(责任编辑：杨明丽)

Detection ofRicestripevirusin individual small brown planthoppers by RT-PCR and dot-ELISA

Zhang Shuiying1,Jiang Chunhe2,Lan Pingxiu1,3,Zhang Xuefeng4,Li Fan1

(1. Key Laboratory of Agricultural Biodiversity and Pest Management of Ministry of Education, Yunnan Agricultural University, Kunming650201, China; 2. Office of Teaching Affairs, Yunnan Agricultural University,Kunming650201, China; 3. College of Animal Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming650201, China; 4. Honghe University, Yunnan661199, China)

The detection rates, sensitivities and cost of RT-PCR and dot-ELISA methods were compared for the detection ofRicestripevirus(RSV) in individual small brown planthoppers (SBPH). The results indicated that RSV could be detected in single SBPH successfully by both methods. The RSV-positive detection rates in single SBPHs by RT-PCR were 11.79%-15.77% lower than that by dot-ELISA; however, the sensitivity of RT-PCR was 10 times higher than that of dot-ELISA. The cost of RT-PCR was also higher. The results suggested that the detection rate of RSV in individual insect vectors by RT-PCR might be lower than that by dot-ELISA. Therefore, dot-ELISA is recommended for the detection of RSV in individual SBPHs when large-scale field samples need to be tested, while RT-PCR is used for accurate analysis of the virus in single SBPHs.

Ricestripevirus;small brown planthopper;RT-PCR;dot-ELISA; detection

2015-01-30

2015-03-31

云南省教育厅科学研究基金重大专项(ZD2012005)；云南省高校科技创新团队支持计划(云教科[2014]22号)

E-mail:zxf197927@163.com；fanlikm@126.com

Q 93-331, S435.111.42

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.02.021