木瓜蛋白酶酶解牦牛血红蛋白制备氯化血红素关键工艺研究

贾志春,张　珍,张盛贵,牛黎莉,赵圆圆,肖雪莉,徐荣荣,包雪梅

(甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州 730070)



木瓜蛋白酶酶解牦牛血红蛋白制备氯化血红素关键工艺研究

贾志春,张珍*,张盛贵,牛黎莉,赵圆圆,肖雪莉,徐荣荣,包雪梅

(甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州 730070)

利用牦牛血中丰富的血红蛋白来制备氯化血红素。以新鲜牦牛血为原材料,通过预处理获得血红蛋白,之后进行酶解获取氯化血红素,在单因素实验的基础上,利用Box-Benhnken中心组合旋转实验和响应面分析法,确定了酶解血红蛋白制备氯化血红素的(酶解温度、酶解时间、pH、酶添加量)最适工艺条件,结果表明,提取氯化血红素的最佳工艺为:酶解温度55 ℃、酶解时间94 min、pH8.0、酶添加量0.08 g。木瓜蛋白酶对酶解牦牛血红蛋白制备氯化血红素有实际意义,在此工艺条件下,氯化血红素的浓度可达6.47 μg/mL。

牦牛血,木瓜蛋白酶,氯化血红素,响应面法

牦牛血液中有丰富的蛋白质,蛋白含量在牦牛全血中为15.5%±0.8%,血浆中为6.9%±0.7%，血细胞中为32.7%±0.9%，是非常理想的蛋白质资源[1-2]。血红素是具有卟啉结构的分子,四个吡咯环上的氮原子与一个亚铁离子配位卟啉分子中心结合,一般生命体内每100 mL血液中铁的含量可达40 mg,是肌肉肌红蛋白中铁含量的10～80倍[3]。血红素主要存在于动物的血液和肌肉中，是动物血液中的天然色素,具有重要的生理功能和很高的实用价值,广泛应用于医药、食品、化工、保健品、建筑及化妆品行业[4-7]。

酶法制备血红素铁由于不用其他有机试剂,是目前最环保的方法,吴宝承[8]等分别选取胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶酶解血红蛋白,结果显示中性效果最好。张亚娟[9]等采用预处理的血红蛋白粉为原料分别用单一酶和复合酶酶解血红蛋白。采用生物酶水解血红蛋白制取富含血红素的生物活性肽,可以有效预防缺铁性贫血,但大多都是鹿血[10]、牛血[11]、猪血[12]血红素提取研究,中国是牦牛的发源地之一,也是当前世界上饲养牦牛数量最多的国家,全国牦牛的存栏总数大约有1400多万头,大约占我国饲养牛[13]总数的16.67%。传统方法提取的血红素,有特殊的味道且有溶剂残留,影响血红素有效利用。本实验利用木瓜蛋白酶将牦牛血红蛋白水解制备氯化血红素,获得纯天然无污染小分子纯度高易被人体吸收利用的血红素,探索酶解优化条件以期为牦牛血红素的开发利用提供理论研究基础和技术支撑。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

新鲜牦牛血甘肃甘南玛曲屠宰厂;血红素标准品(纯度98%)美国sigma公司;木瓜蛋白酶(酶活80万U/g)上海源叶生物科技公司;柠檬酸、甲醛、盐酸、浓硫酸、甲醛、硫酸铜、溴甲酚绿、甲基蓝、无水乙醇、氯化钠、氢氧化钠、硼酸(国产分析纯)。

H-1850R低温离心机;HHS型电热恒温水浴锅;CJJ78-1磁力加热搅拌器;雷磁pHS-3C酸度计;DF-Ⅱ集热式磁力加热搅拌器;电子天平;JY92-ⅡDN超声波细胞粉碎机;K9840自动凯氏定氮仪;T6新世纪紫外可见分光光度计;BPZ-6063真空干燥箱。

1.2实验方法

1.2.1工艺流程新鲜牦牛血→抗凝处理(5000 r/min)→沉淀红细胞→生理盐水洗涤→离心分离→浓缩红细胞→超声波破胞处理→加酶→调节pH→在不同酶解条件下(酶解时间、酶解温度、pH、酶添加量)酶解处理→灭酶→冷却离心→牦牛血红素

1.2.2牦牛血细胞的预处理取一定体积的牦牛血抗凝处理后,以5000 r/min离心15 min,倾出上清液,收集红细胞。取上述红细胞150 mL用等体积(生理盐水)洗涤红细胞,离心,重复2次。加入(1 mol/L的氯化钠和10 mL无水乙醇)搅拌混匀,超声波细胞粉碎机(功率为0.8 kW,处理10 min)参照赵剑龙[14]的方法略有改进。获得细胞破碎液密封冷藏于4 ℃冰箱。

1.2.3酶水解取上述样液加入600 mL蒸馏水参照杨锡洪[15]的方法略有改进,搅拌混匀,加入木瓜蛋白酶与一定量的还原剂半胱氨酸[16],用0.1 mol/L柠檬酸调节pH放入水浴锅启动反应。水解过程中滴加0.1 mol/L的NaOH保持pH恒定。反应结束后,沸水浴15 min灭酶冷却离心获得上清液测定血红蛋白水解度,沉淀用于氯化血红素浓度计算。

1.3测定方法

1.3.1水解度的测定水解度(DH)测定方法根据公式

式中:TN-(Total Nitrogen):总氮量,用微量凯氏定氮法测定[17];AN-(Amino Nitrogen):氨基态氮的含量,甲醛电位滴定法测定[18]。

1.3.2氯化血红素含量的测定采用分光光度法[6]。

1.4酶解工艺单因素实验

1.4.1酶解温度的选择将0.08 g的木瓜蛋白酶加入破胞处理后的细胞液中,采用0.1 mol/L的柠檬酸将pH调节到7.0,分别在温度40、45、50、55、60 ℃下酶解100 min,90 ℃条件下灭酶15 min,冷却后,离心测定上清液的血红蛋白水解度以及沉淀中的氯化血红素浓度。

1.4.2酶解时间的选择将0.08 g的木瓜蛋白酶加入破胞处理后的细胞液中,采用0.1 mol/L的柠檬酸将pH调节到7.0,分别在50 ℃下酶解50、100、150、200、250 min,90 ℃条件下灭酶15 min,冷却后,离心测定上清液的血红蛋白水解度以及沉淀中的氯化血红素浓度。

1.4.3酶解pH的选择将0.08 g的木瓜蛋白酶加入破胞处理后的细胞液中,采用0.1 mol/L的柠檬酸将pH调节到7.0、7.5、8.0、8.5、9.0,在50 ℃下,水解100 min,90 ℃条件下灭酶15 min,冷却后,离心测定上清液的血红蛋白水解度以及沉淀中的氯化血红素浓度。

1.4.4酶添加量的选择将0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 g的木瓜蛋白酶加入破胞处理后的细胞液中,采用0.1 mol/L的柠檬酸将pH调节到7.0,在50 ℃下,水解100 min,90 ℃条件下灭酶15 min,冷却后,离心测定上清液的血红蛋白水解度以及沉淀中的氯化血红素浓度。

1.5响应面实验

在单因素实验基础上,以木瓜蛋白酶的酶解温度、酶解时间、酶解pH、酶添加量作为响应子,氯化血红素的浓度为响应值,进行Box-Behnken的中心组合实验设计,响应面实验设计见表1。

表1　响应面实验因素及编码水平Table 1　Encode table of factors and levels

2　结果与分析

2.1单因素实验结果与分析

2.1.1温度对酶解反应的影响由图1分析可知,在一定温度范围内40～50 ℃,酶解效果与温度成正相关。随着酶解温度的升高,氯化血红素浓度与水解度都增大,当温度为50 ℃时,氯化血红素浓度达到8.24 μg/mL,水解度为13.4%,氯化血红素浓度与水解度都达到了最高,温度继续提高时氯化血红素浓度基本不变,血红蛋白水解度有所下降,当温度为55 ℃和60 ℃时,氯化血红素浓度比50 ℃时下降了3%和4%。由于牦牛血中红细胞破胞后血红蛋白有凝固的趋势不利于后续实验的进行,同时在酶解过程中,适当的提高温度可增加酶的活力[19],促进水解,若温度过高,使血红蛋白和酶变性则对水解不利,因此选择50 ℃为木瓜蛋白酶适宜的酶解温度。

图1　温度对酶解过程的影响Fig.1　Effect of temperature on the enzymatic hydrolysis process注：不同字母表示差异显著(p<0.05)，图2～图4同。

2.1.2pH对酶解反应的影响由图2得出血红蛋白经过不同初始的pH处理后,对氯化血红素浓度和血红蛋白的水解度有较大的影响,随着pH升高氯化血红素浓度和血红蛋白的水解度先增大后减小,在pH8.0时氯化血红素浓度达到4.83 μg/mL,水解度也达到最大,并与其他水平有显著性差异(p<0.05),当pH为8.5和pH9.0时氯化血红素浓度比pH8.0时下降了8%和6%。由于pH作为变性因素的存在,使血红素上的丙酸基与珠蛋白结合的两个化学键及血红素中的铁与珠蛋白组氨酸咪唑环的氮形成的两个配位键断裂[20-22],从而使血红蛋白中的血红素与珠蛋白分离达到水解目的,不同的pH处理会对底物和酶的构象造成较大影响,pH应该控制在反应最适范围内有利于酶活力的充分发挥,因此pH在8.0是较优选择。

图2　pH对酶解过程的影响Fig.2　Effect of pH on the enzymatic hydrolysis process

2.1.3时间对酶解反应的影响从图3可以看出氯化血红素浓度、血红蛋白水解度在实验范围内随着时间的延长,氯化血红素浓度、血红蛋白水解度先增大,在100 min时氯化血红素浓度达到5.97 μg/mL并与其他水平有显著性差异(p<0.05),血红素浓度、水解度变小,当酶解时间为150、200、250 min时,氯化血红素浓度比时间为100 min时下降了2%、4%和6%。酶解时间的长短会直接影响整个反应,水解时间过短导致反应不充分,不能完全水解血红蛋白释放出血红素,水解时间过长时作用底物被消耗水解度随之下降,由于水解产物被氧化以及在体系达到溶解平衡,致使血红素浓度和水解度反而减小[23],从原料利用和水解产物等方面考虑酶解时间取100 min为宜。

图3　时间对酶解过程的影响Fig.3　Effect of time on the enzymatic hydrolysis process

2.1.4酶添加量对酶解反应的影响从图4可以看出,随着酶量增加,氯化血红素的浓度与血红蛋白的水解度量逐渐上升,加酶量0.10 g时血红蛋白的水解度最大。当酶添加量为0.12、0.14 g时氯化血红素浓度相比0.10 g时降低了2%、3%,之后氯化血红素浓度基本不变,水解度缓慢减少,说明底物已经基本被酶饱和了,再增加酶量对反应的贡献不大,因此选择酶添加量0.10 g为较优值。

图4　酶添加量对酶解过程的影响Fig.4　Effect of add the amount of enzyme on the enzymatic hydrolysis process

2.2响应面法确定木瓜蛋白酶水解血红蛋白的最佳工艺

根据Box-Behnken的统计设计原理,参考单因素实验结果,采用响应面分析法对木瓜蛋白酶水解牦牛血红蛋白的工艺进行分析和优化,实验结果如表2所示。

血红素浓度(μg/mL),进行回归分析得到关于酶解时间、温度、pH、酶添加量的四个因素的拟合二次项多项式方程:

Y=6.51-0.23A-0.12B-0.33C-0.042D-0.040AB-0.11AC+0.032AD+8.419E-003BC-0.068BD-0.054CD-0.42A2-0.45B2-0.66C2-0.57D2

2.2.1牦牛氯化血红素浓度的响应面分析图5显示了当酶解温度与酶添加量为中心水平时,酶解时间与pH对氯化血红素浓度的交互作用。酶解时间一定时,氯化血红素浓度随着pH呈现先增大后减小的趋势;当pH不变时,氯化血红素浓度随着pH也呈现先增大后减小的趋势;酶解时间和pH在95～105 min、7.9～8.3之间时,氯化血红素浓度有最大值。

表2　响应面分析方案及实验结果Table 2　Test design and results of response surface analysis

图5　酶解时间、pH对氯化血红素浓度的度的响应面图Fig.5　Hydrolysis time and pH on the hemin concentration response surface

图6显示了当酶解时间与pH为中心水平时,酶解温度与酶添加量对氯化血红素浓度的交互作用。酶解温度一定时,氯化血红素浓度随着酶添加量呈现先增大后减小的趋势;当酶添加量不变时,氯化血红素浓度随着酶解温度也呈现先增大后减小的趋势;酶解温度和酶添加量在52～56 ℃、0.07～0.09 g之间时,氯化血红素浓度有最大值。

图6　酶解温度、酶添加量 对氯化血红素浓度的响应面图Fig.6　Hydrolysis temperature and the amount of enzyme on the hemin of enzyme on the hemin concentration response surface

图7显示了当酶解时间与酶解温度为中心水平时,pH与酶添加量对氯化血红素浓度的交互作用。pH一定时,氯化血红素浓度随着酶添加量呈现先增大后减小的趋势;当酶添加量不变时,氯化血红素浓度随着pH也呈现先增大后减小的趋势;pH和酶添加量在7.7～8.1、0.07～0.09 g之间时,氯化血红素浓度有最大值。

图7　pH、酶添加量对氯化血红素浓度的响应面图Fig.7　Hydrolysis amount of enzyme and pH on the hemin concentration response surface

表3　响应面模型的方差分析Table 3　Variance analysis of response surface model

注:p<0.01 极显著(**);p<0.05 显著(*);p>0.05 不显著(-)。

2.3验证性实验

对氯化血红素浓度取最大值,由软件自动分析可得到氯化血红素提取工艺最佳理论值:酶解温度54.49 ℃、酶解时间93.80 min、pH7.89、酶添加量0.08 g,血红素浓度6.59 μg/mL。考虑实际操作方便,选取酶解温度55 ℃,酶解时间94 min,pH8.0,进行3次平行实验,最终氯化血红素浓度为6.47 μg/mL,与理论值较为接近,说明该数学模型的建立对牦牛血氯化血红素的获取具有可行性。

3　结论

通过单因素(酶解温度、酶解时间、pH、酶添加量)四水平为实验因素,分别以氯化血红素浓度与血红蛋白水解度为考察指标,利用响应面软件对氯化血红素含量为响应值进行模型建立和模型预测,得出牦牛血中氯化血红素最佳提取工艺条件分别为:酶解温度55 ℃、酶解时间94 min、pH8.0、酶添加量0.08 g。在此工艺条件下,水解度为11.8%,氯化血红素的浓度可达6.47 μg/mL,相比理论值减少了1.7%。说明该数学模型对优化牦牛血中氯化血红素提取工艺可行,并为综合利用牦牛血资源提供了理论依据。

利用木瓜蛋白酶酶解牦牛血红蛋白制备氯化血红素相对于有机溶剂法是一种绿色环保的方法,制备过程制备时间短、制备效率高、制备效果好,且获得的氯化血红素后期纯化过程简单残留少,在牦牛血液资源开发方面有较大的空间,其具体的应用以及后期的开发还需要进一步深入探讨。

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Study on the preparation technology of hemin from enzymolysis yak blood by papain

JIA Zhi-chun,ZHANG Zhen*,ZHANG Sheng-gui,NIU Li-li,ZHAO Yuan-yuan,XIAO Xue-li,XU Rong-rong,BAO Xue-mei

(College of Food Science and Technology,Gansu Agriculture University,Lanzhou 730070,China)

Preparation hemin with high content hemoglobin in yak blood. With fresh yak blood as the material to get the hemoglobin through pre-treatment,then through enzymolysis to get the hemin. On the basement of single factor test,using combination Box-Benhnken center rotation experiment and response surface analysis,the best extraction process of hemin from hemoglobin by enzymolysis as follows:55 ℃ for enzymolysis temperature,94 min and pH8.0 for enzymolysis,enzyme concentration was 0.08 g. After optimization,the yield of hemin reached 6.47 μg/mL. The enzymolysis yak blood by papain extract hemin is a useful method.

yak blood;papain;hemin;response surface analysis

2015-07-13

贾志春(1990-)，男，硕士，硕士研究生，研究方向：食品科学，E-mail: 18894049864@163.com。

张珍(1971-)，女，博士，副教授，研究方向：食品科学，E-mail：zhangzhen@gsau.edu.cn。

甘肃省财政厅高校基本业务项目(1011JKCA179)；甘肃省农牧厅生物技术专项(GNSW-2013-22)；甘肃农业大学导师基金项目；甘肃省自然基金(1107RGZA23)。

TS251.1

B

1002-0306(2016)03-0206-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.035