高效液相色谱串联原子荧光法测定鱼类甲基汞的两种前处理方法比较与分析

李继源，孔 佳，柯异芸，肖新峰，包 斌*（上海海洋大学食品学院，上海　0306；上海食品研究所，上海　0035）

高效液相色谱串联原子荧光法测定鱼类甲基汞的两种前处理方法比较与分析

李继源1，孔 佳2，柯异芸1，肖新峰1，包 斌1*
（1上海海洋大学食品学院，上海201306；2上海食品研究所，上海200235）

分别采用超声波辅助提取和提取液提取方法对鱼体中的甲基汞进行前处理，通过高效液相色谱串联原子荧光法分析测定甲基汞含量。结果表明：两种方法均可用于高效液相色谱串联原子荧光法测定鱼类甲基汞的前处理。超声辅助提取和提取液提取的回收率分别为81%—95%和82%—101%；精密度分别为6.7%和5.6%；检测限分别为33.5μg/kg和13.4μg/kg；两种前处理方法测定FAPAS样品得到的测定结果与定值吻合，准确度满足分析要求。超声波辅助提取相对提取液提取简便、经济性较好，而提取液提取相对超声波辅助提取试验耗时短、检出限低，在对未知浓度甲基汞（痕量）进行测定时，提取液提取相对超声波辅助提取更为可靠。

甲基汞；鱼肉；高效液相色谱串联原子荧光法；超声波辅助提取；提取液提取

汞俗称水银，是地壳中唯一的液态金属。在自然条件下，仅极少量汞以金属态存在，大多以无机汞、甲基汞、乙基汞及其他有机化合物形式存在［1］。其中甲基汞是一种具有神经毒性的环境污染物，可侵犯中枢神经系统，造成语言和记忆能力障碍［2-3］，且其在体内具有易吸收、不易降解、难以排泄等特点［4］。人类活动造成水体汞污染，水中的无机汞可由微生物作用转变成甲基汞，并在水生生物食物链不断富集，当甲基汞在鱼体内积累，就可能危害人类健康。国家标准GB 2762—2012和农业行业标准NY 5073—2006对食品中污染物限量规定：非食肉鱼类水产品和食肉鱼类水产品中甲基汞含量应分别不得大于0.5 mg/kg和1.0 mg/kg。对鱼体内甲基汞含量测定的方法包括：原子吸收光度法［5］、原子荧光光谱分析法［6］、气相色谱法［7］、高效液相色谱法［8］、液相联用原子荧光（HPLC-AFS）和高效液相联用电感耦合等离子体质谱（HPLC-ICP-MS）［9-10］等。国家标准GB/T 5009.17—2003规定采用气相色谱法测定甲基汞，该方法灵敏度高，但前处理复杂，容易在前处理过程中损失［11］；中国出入境检验检疫行业标准（SN/T 3034—2011）规定采用高效液相色谱与原子荧光光谱联用（HPLC-AFS）测定甲基汞，此方法具有灵敏度高、检出限低、仪器使用成本低［12］等优势。

本研究采用超声波辅助提取和提取液提取两种方法提取鱼肉中的甲基汞，其中超声波辅助提取采用盐酸配合超声波进行提取，提取液提取参照出入境检验检疫行业标准（SN/T 3034—2011），采用盐酸-硫脲-氯化钾混合液进行提取。超声波辅助提取因提取效率高、提取温度低、适应性广、提取工艺运行成本低、操作简单而适用；提取液提取因前处理较为简单、回收率稳定、灵敏、杂质干扰少而适用。目前，未见对高效液相串联原子荧光分光光度法检测鱼肉中甲基汞的前处理方法进行比较分析的报道，本研究比较超声波辅助提取和提取液提取对鱼肉甲基汞含量测定的影响，以期为鱼类体内甲基汞检测提供方法依据。

1　材料与方法

1.1试剂

甲基汞标准溶液购自中国计量科学研究院；乙腈（色谱纯）；氩气（纯度＞99.999%）、L-半胱氨酸、乙酸铵、盐酸、氢氧化钠、硼氢化钠、氨水均为优级纯；试验用水为去离子水。

1.2仪器与设备

AFS-9800双道原子荧光光度计、汞空心阴极灯、SAP-20形态分析仪（北京吉天仪器有限公司）、C18分析柱（150 mm×4.6 mm，3.5μm，waterssunfire）、电子天平、组织匀浆机、超声波清洗器、涡旋振荡器、台式高速离心机、pH计。

1.3方法

1.3.1样品前处理

1.3.1.1超声波辅助提取

切取鱼肉组织经匀浆器匀浆后，准确称取样品0.5g（精确至0.0001g），置于15 mL离心管中，加入10 mL 5 mol/L HCl提取试剂，密封放置过夜。在室温下超声提取60 min后，7 000 r/min离心10 min。取2.00 mL上清液于离心管中并用NaOH调节pH至2—8，加入0.2 mL L-半胱氨酸溶液定容至5 mL，7 000 r/min离心10 min，取上清液过0.45μm微孔滤膜过滤，滤液保存备用。

1.3.1.2提取液提取

切取鱼肉组织经匀浆器匀浆后，准确称取样品0.5g（精确至0.0001g），加入2.00 mL的提取液（质量分数10%HCl溶液+1%硫脲+0.15%KCl溶液），混合3 min，7 000 r/min离心10 min后取上清液，沉淀中加入2.00 mL提取液再提取1次，合并2次上清液，用氨水调节pH至2—8，7 000 r/min离心10 min后取上清液，保存待用。用5 mL甲醇和5 mL纯水活化C18小柱，上清液通过C18小柱上样，再用4 mL流动相两次洗脱，接收样品流出液和洗脱液，最后用流动相定容至10 mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，滤液保存备用。

1.3.2色谱条件、原子荧光仪条件和形态分析预处理装置条件

色谱条件：色谱柱为C18柱（150 mm×4.6 mm，3.5μm，watersunfire）；流动相为5%乙腈 +4.62g/L乙酸铵+1.2g/L半胱氨酸，流速1.0 mL/min；柱温为30℃；进样量为100μL；泵转速为60 r/min。

原子荧光仪条件：总电流30 mA、负高压 280 V、载气为高纯氩气，流速300 mL/min、屏蔽气流速500 mL/min。

形态分析预处理装置条件：开启紫外灯；还原剂为0.5%KOH和2%KBH4溶液；载流为质量分数7% HCl溶液。

1.3.3标准曲线的绘制

吸取相应的标准储备液，用流动相稀释成含甲基汞质量浓度为5μg/L、10μg/L、20μg/L、60μg/L的标准工作液，现用现配。以峰面积为纵坐标、甲基汞质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2　结果与分析

2.1仪器条件选择

2.1.1流动相的优化

试验分别采用5%乙腈+4.62g/L乙酸铵+1.2g/L L-半胱氨酸和3%乙腈+4.62g/L乙酸铵+ 1.2g/L L-半胱氨酸作为流动相。乙腈对于汞与络合剂生成的络合物有较好的溶解性，流动相中含有乙腈能避免色谱峰的拖尾和变宽。乙腈的含量对分析物的保留时间影响较大，试验对3%乙腈和5%乙腈形成的色谱图进行比较，乙酸铵和L-半胱氨酸浓度不变。如图1所示，随着乙腈浓度升高，甲基汞保留时间缩短，峰形更尖锐对称，所以采用5%乙腈比较合适。

图1　流动相中不同浓度乙腈的甲基汞色谱图Fig.1　Chromatogram of methyl mercury in mobile phase withdifferent concentrations of acetonitrile

2.1.2原子荧光光谱条件的确定

将负光电倍增管负高压设置为270 V、280 V、290 V、300 V进行比较，发现基线随着电压的升高而升高，但考虑到仪器灵敏度及使用条件限制，选用光电倍增管负高压为280 V作为试验条件；汞空心阴极灯电流选用30 mA，当电流增强到30 mA后，信号强度基本不变。随着使用时间的延长，电流升高会造成汞灯的老化，影响仪器的灵敏度，故选择30 mA作为汞灯电流；载气流速300 mL/min、屏蔽气流速500 mL/min。

图2　还原剂KBH4浓度对甲基汞响应值的影响Fig.2　Effect of reducing agent KBH4concentration on the response value of methyl mercury

2.1.3还原剂的选择

试验前将原子荧光光谱仪调至最佳状态，优化氢化物反应条件，本试验采用0.3%、0.5%、1%、2%、3%的KBH4和0.5%的NaOH作为还原剂，其余条件不变。如图2所示，当硼氢化钾浓度为3%时，甲基汞的响应值最大，但硼氢化钾浓度2%与3%相差不大，从节约试验原料的角度考虑，采用2%硼氢化钾作为还原剂。

2.1.4氧化方式的选择

色谱分离后的甲基汞复合物首先需要柱后氧化，与氧化剂混合后进入紫外消解系统，在紫外线的照射下甲基汞被氧化转化为无机汞。中国出入境检验检疫行业标准（SN/T 3034—2011）及部分学者一般使用K2S2O8和KOH/NaOH混合溶液作为氧化剂［13-14］，本试验采用高强度的紫外消解装置，从而使用水替代K2S2O8和KOH/NaOH混合溶液的氧化剂，结果见图3。通过比较可知，氧化方式用强紫外照射代替氧化剂为K2S2O8和KOH/NaOH的混合溶液，所得峰形与后者相近，且峰形尖锐对称，无拖尾和变宽。因为本试验所采用的形态分析仪配备高强度的紫外消解装置，所以可以采用水替代 K2S2O8和KOH/NaOH混合溶液的氧化剂。

2.1.5蠕动泵转速优化

蠕动泵转速可影响还原剂与载流的流量从而对氢化物的生成造成直接影响。本研究采用还原剂0.5%NaOH+2%KBH4、载流为7%HCl。通过固定还原剂浓度，改变蠕动泵转速来研究对氢化物生成的影响。用甲基汞标准溶液进样，转速分别设置为30 r/min、40 r/min、50 r/min、60 r/min、70 r/min、80 r/min。由图4可知，转速为60 r/min时，甲基汞标准溶液响应的峰面积和峰高均达到最大，故选择60 r/min为蠕动泵转速。

图3　不同氧化方式对甲基汞响应值的影响Fig.3　Effect ofdifferent oxidation methods on the response value of methyl mercury

图4　蠕动泵转速对氢化物产生的影响Fig.4　Effect of the rotationspeed of peristaltic pump on hydridegeneration

2.2方法检出限与线性范围

配置质量浓度为2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、40μg/L、60μg/L的甲基汞标准溶液，在上述条件下测定并计算，以质量浓度作为横坐标、峰面积作为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为y=17 141x-38 067，相关系数为r2=0.9994，甲基汞在0—60μg/L质量浓度范围内呈良好的线性关系。

在上述条件下，以仪器性噪比S/N=3计算，甲基汞的仪器最低检出限为0.67μg/L，按照样品前处理的浓缩倍数关系及最低回收率得出超声波辅助提取的检出限为33.5μg/kg，提取液提取的检出限为13.4μg/kg。通过比较可知，两种前处理方法测定低浓度含量甲基汞时，采用提取液提取略优于超声波辅助提取。

2.3精密度及加标回收试验

选取草鱼作为试验材料，分别加入10μg/L、20μg/L、50μg/L 3个浓度的甲基汞标准溶液，进行精密度和加标回收试验，每个水平6个重复，按照上述两种前处理方法进行提取、净化、测定，用外标法计算方法的回收率。同时选取大黄鱼作为原料，重复测定6次，验证精密度。

如表1、表2所示，在10μg/L、20μg/L、50μg/L 3个加标水平下，超声波辅助提取回收率为81%—95%，RSD%为3.83%—4.10%；提取液提取回收率为82%—101%，RSD%为3.70%—6.82%。超声波辅助提取测定大黄鱼样品RSD%为6.70%，提取液提取测定大黄鱼样品 RSD%为5.60%。通过比较可知，两种前处理方法回收率及精密度相差不大，且均满足试验要求，因此两种前处理方法均可用于测定鱼肉中的甲基汞。

表1　草鱼添加甲基汞标准溶液回收率及精密度测定结果Table 1　Results of recovery and precision of thestandardsolution of methyl mercury ingrass carp　μg·L-1

表2　大黄鱼中甲基汞精密度试验结果（n=6）Table 2　The test results of methyl mercury precision in large yellow croaker

2.4方法准确性

使用两种前处理方法测定冷冻干燥的FAPAS罐装鱼肉样品（T07189）中的甲基汞含量，结果见表3。超声波辅助提取法测定的值为给定值的（96.5±1.3）%，提取液提取法测定的值为给定值的（96.3± 1.3）%。两种前处理方法得到的测定结果与定值吻合，准确度满足分析要求。

表3　不同提取方法准确性对比（n=6）Table 3　Accuracy comparison ofdifferent extraction methods

2.5实际样品测定

用两种前处理方法分别处理上海市市售6种鱼，并进行甲基汞含量测定，结果见表4。两种前处理方法均测出待测海水鱼样品中的甲基汞，2种淡水鱼均未检出甲基汞，且两种方法检测结果差异不显著，说明两种前处理方法均可用于实际样品的检测。根据GB 2762—2012食品中污染物限量规定，我国将肉食性鱼类及其制品甲基汞含量限定在≤1 000μg/kg范围内，水产动物及其制品中甲基汞含量限定在≤500μg/kg，以上所测水产品甲基汞含量均低于国家标准。

表4　样品中甲基汞含量的测定结果（n=6）Table 4　Determination results of the content of methyl mercury in thesamples

3　结论

本试验采用超声波辅助提取和提取液提取两种前处理方法对样品进行前处理，随后用高效液相色谱串联原子荧光光度计测定鱼肉中的甲基汞含量。试验中采用5%乙腈-4.62g/L乙酸铵-1.2g/L L-半胱氨酸作为流动相，用反相C18柱分离，采用强紫外氧化方式取代K2S2O8和KOH/NaOH混合溶液，发现两种前处理方法均能够满足试验需要。在原子荧光光谱优化条件下进行测定，结果表明：两种前处理方法加标回收率、检出限、精密度等指标均能满足试验要求，杂质干扰少，适用于鱼类中该类物质检测分析。超声波辅助提取相对于提取液提取，因为不需要消耗C18小柱，所以在处理大批量样品时试验成本低，且前处理步骤相对提取液提取更为简便。但在对未知浓度甲基汞（痕量）进行测定时，因为提取液提取检出限比超声波辅助提取更低，采用提取液提取相对超声波辅助提取更为可靠。

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（责任编辑：闫其涛）

Comparison and analysis of two pretreatment methods fordetermination of methyl mercury in fish by HPLC-AFS

LI Ji-yuan1，KONG Jia2，KE Yi-yun1，XIAO Xin-feng1，BAO Bin1*
（College of Foodscience and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；Shanghai Food Research Institute，Shanghai 200235，China）

Two pretreatment methods，ultrasonic-aid extraction andsolvent extraction，fordetermination of methyl-mercury in fish by high performance liquid chromatography coupled with atomic fluorescencespectrometry （HPLC-AFS）were compared and analyzed.The resultsshowed that both pretreatment methods were qualified for the methyl mercurydetermination ofdifferent fishsamples by HPLC-AFS.The recovery，precision anddetection limit of ultrasonic assisted extraction andsolvent extraction were 81%—95%and 82%—101%，6.7%and 5.6%，33.5μg/kg and 13.4μg/kg，respectively.Thedetermination results of FAPASsamples by the two pretreatment methods were consistent with the fixed value，and the accuracy wassatisfied.Ultrasonic assisted extraction was moresimple and economic thansolvent extraction，whilesolvent extraction wasshort timeconsuming and had lowerdetection limit.Solvent extraction is more reliable indetermination of unknown concentration（trace quantity）of methyl mercury.

Methyl mercury；Fish tissue；HPLC-AFS；Ultrasonic assisted extraction；Solvent extraction

TS254.7

A

1000-3924（2016）04-081-06

2015-05-12

李继源（1988—），男，在读硕士，研究方向：食品重金属风险评估

，E-mail：bbao@shou.edu.cn