正交试验法优化稗属植物 ISSR-PCR反应体系

刘德好，陆永良，娄玉霞，郭水良*（上海师范大学生命与环境科学学院，上海　0034；中国水稻研究所，杭州　30006）

正交试验法优化稗属植物ISSR-PCR反应体系

刘德好1，陆永良2，娄玉霞1，郭水良1*
（1上海师范大学生命与环境科学学院，上海200234；2中国水稻研究所，杭州310006）

利用正交设计方法，对稗属植物ISSR-PCR反应体系的4个因素（TaqdNA聚合酶、引物、dNTPs和模板DNA）在4个水平上进行优化，建立了稗属植物ISSR-PCR的最佳反应体系（20μL）：TaqdNA聚合酶0.5 U、引物0.1μmol/L、dNTPs 200μmol/L、DNA模板150 ng。共筛选出9条适合稗属植物ISSR-PCR的引物，并确定了每条引物的最适退火温度，可为后续利用ISSR技术开展稗属植物鉴定和多样性研究提供技术支持。

稗属植物；正交设计；ISSR-PCR；反应体系

稗属（Echinochloa Beauv.）杂草是一种在全球范围均有分布的恶性杂草，对农作物造成了严重的危害。受生态环境、耕作方式等多方面因素的影响，稗属种内在形态甚至基因上都出现了不同程度的变异，增加了稗属杂草的分类以及防除的难度［1］。ISSR分子标记技术有相对可靠的稳定性和重复性，具有多态性水平高、DNA用量少和成本低等优点，已广泛应用于遗传多样性分析和种质鉴别等研究［2-3］。

ISSR是一种基于PCR的分子标记技术，不同的反应体系和反应程序会导致不同的结果，为了得到稳定可靠的试验结果，对ISSR-PCR反应体系进行优化十分必要。本试验采用正交设计法对稗属植物ISSRPCR反应体系的4个因素（TaqdNA聚合酶、引物、dNTPs和模板DNA）在4个水平上进行优化，以期建立稗属植物最优反应体系，为其遗传多样性分析和种质鉴别提供技术依据。

1　材料与方法

1.1材料

本试验所用材料为长芒稗（Echinochloa caudata Roshev.），采自福建省三明市尤溪县新阳镇大坋村。

1.2试剂

TAKARA LA Taq（Code No.RR02MA），附带试剂10×LA PCR BufferⅡ（Mg2+Plus）、dNTPs Mixture （2.5 mmol/L each）。采用哥伦比亚大学设计公布的ISSR引物（http://www.michaelsmith.ubc.ca/services/ NAPS/Primer_Sets/Primers_Oct2006.pdf），由上海生工合成。

1.3方法

1.3.1DNA的提取和浓度检测

使用天根植物基因组试剂盒提取长芒稗叶片DNA，利用BeckmandU-640核酸蛋白分析仪测定DNA浓度和纯度。DNA样品保存于-20℃冰箱中备用，作为PCR扩增的模板。

1.3.2PCR正交试验的设计

针对酶量、模板DNA、dNTPs及引物4个因素设计4个水平（表1），选用L16（4×4）正交表，设计PCR扩增体系优化的因素-水平正交设计试验表（表2）。

表　1 正交设计水平因素表Table 1　Factors and levels of orthogonaldesign

表　2 稗属植物　ISSR-PCR正交试验设计表　L16（4×4）Table 2　ISSR-PCR reaction of L16（4×4）for Echinochloa

试验共设16个处理，每个处理重复3次，反应体系20μL，引物选用UBC807。反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃复性1 min，35个循环；72℃下延伸10 min后，4℃保存。PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳，电泳电压100 V，电泳50 min。以2 000 bpdNA标准分子量作为分子量标记。使用Tanon 2500凝胶图像分析系统进行拍照和分析。

1.3.3引物的筛选和退火温度的确定

由于每个引物的碱基序列不一样，同一序列在不同物种基因组中出现的频率也不一致，在合成的100个引物中不是所有的引物都可以扩增出稳定的条带，扩增出的条带也不一定具有多样性，所以在正式试验前需要对90个引物进行初步的筛选。本试验选取长芒稗DNA作为模板，用正交试验所得最佳反应条件对90个引物进行扩增，选取扩增条带丰富、背景清晰和稳定性好的引物。

退火温度不仅和引物的序列有关，而且和物种基因组序列有关［4］。同一引物在对不同物种基因组进行扩增时，所需要的最佳退火温度也是不一致的。因此，适宜的退火温度对于稗属植物ISSR扩增反应的结果十分重要。本试验退火温度的跨度设置为12℃，由PCR仪自动生成12个温度梯度。对所筛选出的所有引物逐一进行温度梯度PCR，以确定每个引物的最佳退火温度。使用正交试验得到的最佳反应体系对哥伦比亚大学设计并公布的100条ISSR常用引物进行筛选，并采用温度梯度PCR模式，设定温度48—60℃，自动生成12个温度梯度：48.0℃、48.3℃、49.0℃、50.2℃、51.7℃、53.3℃、54.7℃、56.3℃、57.8℃、59.0℃、59.7℃、60.0℃，逐一确定特异性引物的最适退火温度。

1.3.4正交试验结果的极差和方差分析

参照何正文等［5］的方法，依据电泳条带丰富度、清晰度和背景色深度对16个泳道分别进行赋值：条带最丰富、主带清晰以及背景亮度低为最佳，定为16分；与此相反的则评为1分。3次重复试验独立评分，合并统计分析。统计同一水平下各因素的分数之和（K1、K2、K3和K4），计算出各因素的极差R。极差一定程度上反应了该因素对整个反应体系的影响程度，极差越大，表明该因素对反应的影响越强烈。

以各因素对4个水平下的3次重复处理的电泳结果（赋值）为基础，对各因素在4个不同处理水平之间的差异作单因素方差分析。

2　结果与分析

2.1稗属植物ISSR-PCR反应体系的优化

2.1.1正交试验结果的对比分析

扩增产物凝胶电泳结果（图1）表明，处理T4、T6、T7、T12和T13条带数较多，处理T12和T13主带明亮、背景清晰。因此，用直接对比法可以推断出处理T12和T13对于稗属植物ISSR-PCR扩增结果最好。

图1　正交试验　PCR产物电泳图Fig.1　PCR electrophoresis map of orthogonal tests

2.1.2正交试验结果的极差分析

正交试验各因素处理水平和对应处理所得结果的赋值累积分见表3，各因素在4个处理水平下的试验结果赋值累积总值的极差见表4。16个处理中，累积分值以T12、T13较大，分别为46和47（表3），各因素的极差由大到小分别是dNTPs（85）、引物（57）、Taq酶（43）和DNA模板（36）（表4），即dNTPs对稗属植物ISSR-PCR反应影响最显著，引物次之，随后是Taq酶，模板对反应结果的影响最弱。

表3　正交试验各因素处理水平和对应处理所得结果的赋值累积分Table 3　Levels of each factor of orthogonal tests and their assignment cumulativescores

表4　dNTPs、引物、Taq酶和模板在4个处理水平下的分别累积分总和及极差Table 4　Total assigned values and range ofdNTPs，primer，TaqdNA polymerase and template of 4 treatment levels

2.1.3各因素对ISSR-PCR扩增影响的方差分析

方差分析同样表明，dNTPs不同浓度水平对稗属植物ISSR扩增反应结果的影响最为显著，引物浓度次之，模板浓度对反应的影响最小（表5）。

图2直观地表达了dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA浓度对ISSR-PCR反应的影响，结果表明：dTNPs浓度在200—300μmol/L、引物浓度在0.1μmol/L、Taq酶在1.5 U、模板DNA在150 ng时有最好的扩增结果，对应的处理分别是12和13。

表5　ISSR-PCR正交试验各因素间的方差分析Table 5　Variance analysis for factors of orthogonal tests of ISSR-PCR

图2　各因素的不同水平对稗属植物　ISSR-PCR反应的影响Fig.2　Influence ofdifferent levels of each factor on ISSR-PCR reaction of Echinochloa

2.2稗属植物ISSR-PCR扩增引物的筛选和退火温度的确定

本试验选取长芒稗作为模板，用正交试验所得最佳反应条件对90个引物进行扩增，选取扩增条带丰富、背景清晰和稳定性好的引物。经过PCR扩增对90条引物进行筛选后，对筛选出的引物逐一进行温度梯度PCR，结果发现808、826、827、856、857、888、889、890、891这9条引物有较好的扩增结果（图3）。对筛选出的9条引物逐一进行温度梯度PCR，确定每个引物的最佳退火温度（图4、表6）。

图3　筛选引物的PCR产物部分电泳图Fig.3　Partial electrophoresis map of PCR forscreening primers

图4　部分引物的温度梯度　PCR产物电泳图Fig.4　Electrophoresis map oftemperaturegradient PCR ofsome primers

表6　筛选得到的9个引物及其退火温度Table 6　Screening of the 9 primers and their annealing temperature for ISSR

3　讨论

PCR扩增过程中，当dNTPs浓度过小时，dNTPs在扩增反应结束前消耗殆尽，导致扩增产物量降低；而dNTPs浓度过高又会产生不必要的浪费，而且过多的dNTPs还会和Mg2+结合，降低Mg2+相对浓度，导致LA Taq酶活性降低。根据方差分析结果，在本试验中，dNTPs对PCR扩增反应的影响最大，这与周凌瑜等［6］的研究结果相似。从图2A可看出，dNTPs浓度在100—300μmol/L范围内结果均值随浓度的增加而增加，在300μmol/L时反应效果最佳，但是方差分析发现，200—300μmol/L范围内差异不显著，为了节约成本，把dNTPs的最佳反应浓度定在200μmol/L。

一般PCR扩增反应中，引物浓度通常在0.5μmol/L左右［7］。扩增反应中，引物过少会导致扩增产量不足；而引物过多又会增加非特异的扩增，导致条带模糊，背景色加深。在本试验设计浓度范围内，扩增得到的条带数随着引物浓度的增加而降低（图2B），但是这种差异不显著，因此将引物浓度定在0.1μmol/L。

本试验中，Taq酶浓度对稗属植物ISSR扩增反应结果影响显著。高浓度的酶会显著减少扩增的条带数。当Taq酶浓度为1.5U/（20μL）时，结果均值达到最大9.538（图2C）。但是Taq酶浓度在0.5—1.5U/（20μL）范围内对稗属植物ISSR扩增反应结果无明显影响，所以Taq酶选择0.5U/（20μL）。

前人研究表明，模板浓度对扩增反应结果的影响较小，最适扩增反应浓度通常情况下会有一个很大的跨度［8］。本试验也发现模板浓度在4个水平下的扩增效果没有明显差异，只是在150 ng/（20μL）时稍佳（图2D）。

不同引物有着各自的最佳退火温度，适宜的退火温度有利于提高扩增条带的清晰度、丰富度以及扩增结果的稳定性。

综上所述，利用正交试验方法优化稗属植物ISSR-PCR反应条件，最终确定稗属植物20μL最佳反应体系：10×buffer 2μL、dNTPs 200μmol/L、Taq酶0.5U、模板150ng、引物0.1μmol/L。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、52℃（实际温度依各引物最佳退火温度为准）退火30s、72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min，最后4℃保存。

［1］National Field Researchgroup.China’s field weeds regionization［J］.J Weedsci，1989，3（2）：1-5.

［2］QIAN W，GEs，HONGd Y.Genetic variation within and alnong populations of a wild rice Oryzagranulata from Chinadetected by RAPD and ISSR markers［J］.Theor APPLgenet，2001，102：440-449.

［3］DEVARUMATH R M，NANDYs，RANI V，et al.RAPD，ISSR and RFLP fingerprintings as useful markers to evaluategenetic integrity of micro propagated plants of threediploid and triploid elite tea clones representing Camelliasinensis（China type）and C.assamicassp［J］.Plant Cell Reports，2002，21：166-173.

［4］ZENG J，ZOU Y P，BAI J Y，et al.Preparation of TotaldNA from“Recalcitrant Plant Taxa”［J］.Acta Botsin，2002，44（6）：694-697.

［5］何正文，刘运生，陈立华，等.正交设计直观分析法优化PCR条件［J］.湖南医科大学学报，1998，23（4）：403-404.

［6］周凌瑜，吴晨炜，唐东芹，等.利用正交设计优化小苍兰ISSR-PCR反应体系［J］.植物研究，2008，2（4）：402-407.

［7］林萍，张含国，谢运海.正交设计优化落叶松ISSR-PCR反应体系［J］.生物技术，2005，15（5）：34-37.

［8］杨志玲，冯刚利，谭梓峰，等.红花石蒜ISSR-PCR反应体系的建立［J］.林业科学研究，2006，19（4）：509-512.

（责任编辑：闫其涛）

Optimization of ISSR-PCR reactionsystem of Echinochloa by orthogonaldesign

LIUde-hao1，LU Yong-liang2，LOU Yu-xia1，GUOshui-liang1*
（1College of Life and Environmentsciences，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China；2China National Rice Research Institute，Hangzhou 310006，China）

By orthogonaldesign，four factors includingdNTPs，TaqdNA polymerase，primers and templatedNA werestudied to establish an optimum ISSR-PCR reactionsystem.The optimum reactionsystem in 20μL contained 0.5 U TaqdNA polymerase，0.1μmol/L primers，200μmol/LdNTPs and 150 ng templatedNA.Nine primers wereselected for Echinochloa ISSR-PCR.Through thegradient PCR test，the optimal annealing temperatures for ISSR-PCR reaction of 9 primers were alsodetermined，respectively.Thissystem provides a technicalsupport for the identification，diversitystudy of Echinochloa.

Echinochloa；Orthogonaldesign；ISSR；PCR reactionsystem

Q78

A

1000-3924（2016）04-017-05

2015-05-19

国家水稻产业体系项目（nycytx-01）“稻田杂草防控技术研究与示范”作者简介：刘德好（1986—），男，硕士，研究方向为杂草科学

，E-mail：gsg@shnu.edu.cn