高速逆流色谱分离纯化雪白睡莲花中的酚类成分

买吾拉江·阿不都热衣木，李晨阳，李 倩，徐 芳，吉腾飞，赵 军*

(1.新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐 830046；2.新疆药物研究所维吾尔药重点实验室，新疆乌鲁木齐 830004；3，中国医学科学院北京协和医学院药物研究所天然药物活性成分与功能国家重点实验室，北京100050)



高速逆流色谱分离纯化雪白睡莲花中的酚类成分

买吾拉江·阿不都热衣木1，李晨阳2，李 倩1，徐 芳2，吉腾飞3，赵 军2*

(1.新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐 830046；2.新疆药物研究所维吾尔药重点实验室，新疆乌鲁木齐 830004；3，中国医学科学院北京协和医学院药物研究所天然药物活性成分与功能国家重点实验室，北京100050)

[目的] 采用高速逆流色谱法(HSCCC)分离纯化雪白睡莲花中的酚类成分。[方法] HSCCC分离过程分为两步，分别采用乙酸乙酯∶甲醇∶水(4∶1∶5)和乙酸乙酯∶正丁醇∶水(4∶1∶5)两个体系，固定相均采用上相，流动相均采用下相，流速为2.0 mL/min，主机转速设定为850 r/min，紫外检测波长为254 nm。高效液相色谱(HPLC)检测纯度。[结果] 第一步从200 mg 的睡莲花提取物中分离得到异槲皮苷(I，41.4 mg)、紫云英苷(II，40 mg)和一混合物85 mg；第二步从混合物中分离纯化得到isostrictiniin(III，50.1 mg)和烟花苷(IV，26.3 mg)，上述4种物质的纯度分别为73.53%、92.42%、82.36%和85.65%。[结论] HSCCC可快速的分离纯化雪白睡莲花中的酚类成分。

雪白睡莲花；高速逆流色谱；酚类成分

雪白睡莲花为睡莲属多年生水生草本植物雪白睡莲(NymphaeacandidaPresl)的干燥花蕾，主要分布于我国新疆的伊犁、阿勒泰和博湖地区。该植物为维吾尔医习用药材，具有清热解毒、镇静安神之功效，在临床上主要用于热症引起的头痛、热感咳嗽及小儿急、慢惊风等病症的治疗[1]，收载于《中华人民共和国药品标准维吾尔药分册》等医药文献中[2]。现代药理学研究表明，睡莲属植物具有抗氧化、抗肝炎、降血压、降血糖等多种生物活性[3-5]。烟花苷等酚类化合物是该属植物的主要特征性成分[6]。然而目前为止对睡莲花中该类成分的快速分离却鲜见文献报道。因此，为了该药材质量标准及其相关对照品的研究，需要建立有效成分快速高效的分离纯化方法。高速逆流色谱(High speed counter-current chromatography，HSCCC)具有分离速度快、样品损失小的特点，是近年来广泛用于天然有效成分分离纯化的色谱技术[7-10]。笔者在前期研究基础上运用HSCCC方法从200 mg雪白睡莲花提取物中分离得到了4种化合物，分别为异槲皮苷(图1 I，41.4 mg)、紫云英苷(图1 II，40mg)、isostrictiniin(图1 III，50.1 mg)和烟花苷(图1 IV，26.3 mg)，其纯度分别为73.53%、92.42%、82.36%和85.65%，旨在为睡莲花质量控制方法的建立提供依据。

图1　睡莲花中酚类成分的化学结构Fig.1　Chemical structures of phenolic compounds from Nymphaea candida

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1药材。雪白睡莲花药材购自新疆维吾尔药业有限公司，由新疆药物研究所何江副研究员鉴定为雪白睡莲花(NymphaeacandidaPresl)的干燥花蕾。

1.1.2试剂。异槲皮苷、紫云英苷、isostrictiniin和烟花苷对照品由该研究室自制，含量均大于95%。D101大孔吸附树脂购自天津兴南允能高分子技术有限公司；聚酰胺树脂购自浙江台州四甲生化材料厂；乙腈、甲醇为色谱纯，乙醇等其他试剂为国产分析纯。

1.1.3仪器。TBE-300B高速逆流色谱仪由上海同田生化技术有限公司生产；N2000色谱工作站由浙江大学智达信息工程有限公司生产；SPD-10Avp高效液相色谱仪由日本岛津公司生产；AS系列超声波清洗机由天津奥特赛恩斯仪器有限公司生产。

1.2方法

1.2.1睡莲花提取物的制备。睡莲花药材脱脂后，以料液比1∶25(g/mL)加入70%乙醇，回流提取3次，每次提取0.5 h，过滤，合并提取液，减压浓缩至浸膏。然后将睡莲花提取物浸膏以适量蒸馏水溶解后上D101大孔树脂，先分别用5倍柱体积的水和30%乙醇除杂，再以50%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏。浸膏以水混悬溶解后上聚酰胺吸附树脂，先以5倍柱体积水除杂，再用60%乙醇梯度洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥备用。

1.2.2HSCCC溶剂体系的确定。选择乙酸乙酯∶水(5∶5)、乙酸乙酯∶甲醇∶水(4∶1∶5)、乙酸乙酯∶正丁醇∶水(4∶1∶5)和乙酸乙酯∶乙醇∶水(4∶1∶5)作为进行HSCCC的溶剂体系。各溶剂体系配制后充分振摇，然后静置分层，分别取上、下相溶剂各3.0 mL，置于装有5 mg样品的具塞试管中，充分振摇溶解后静置分层，分别取上下相溶液以HPLC检测，计算分配系数K，K=A1/A2(A1和A2分别为上相和下相各色谱峰的峰面积)。

1.2.3HSCCC法分离纯化睡莲花提取物中的有效成分。试验前将达到平衡的两相溶剂系统按上相和下相分别放入试剂瓶中，超声脱气20 min。将上相(固定相)以10 mL/min的速度泵入HSCCC螺旋管中，待螺旋管充满后，缓慢调节主机转数至850 r/min，同时以2.0 mL/min的速度将下相(流动相)泵入其中，待两相平衡后取样品200 mg溶于上下相各5 mL的混合溶液中，由进样阀注入到螺旋管中，同时开始采集数据。

1.2.4HPLC检测分析。采用HPLC检测各色谱峰的纯度。色谱条件：Phenomenex C18柱(250×4.6，5 μm)，梯度洗脱程序(0 min～15 min～20 min，21%A～25%A～21%A)；流动相为乙腈(A)∶0.2%磷酸水溶液(B)，柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，检测波长254 nm。

2　结果与分析

2.1HSCCC溶剂系统的选择溶剂系统的选择是通过目标成分的分配系数K、分离度等因素决定的，目标成分在不同溶剂体系中的K值见表1。在4种溶剂系统中，各化合物的K值差异较大，能够保证各化合物间具有较好的分离度。然而，在溶剂系统①和③中，化合物I和II的K值太大，分离时间长，效率低。乙酸乙酯-甲醇-水(4∶1∶5，②)和乙酸乙酯-乙醇-水(4∶1∶5，④)系统有合适的K值，对分离纯化睡莲花酚类成分较为合适，然而溶剂系统④在HSCCC上的保留率低，故选择乙酸乙酯∶甲醇∶水(4∶1∶5)系统进行睡莲花酚类成分的分离，分别得到组分I( 41.4 mg)、II(40 mg)以及III和IV的混合物(85 mg)。溶剂系统③对化合物III和IV有较好的分离度，进一步选择该体系从该混合物中分离纯化得到化合物III(50.1 mg)和IV(26.3 mg)。该体系分离效果好，固定相保留率43.1%。HSCCC分离纯化效果见图2。

表1　睡莲花酚类成分在不同溶剂系统中的分配系数

注：a.乙酸乙酯∶甲醇∶水(4∶1∶5)；b.乙酸乙酯∶正丁醇∶水(4∶1∶5)。Note: a.Ethyl acetate ∶ methanol ∶ water(4∶1∶5);b. Ethyl acetate ∶ n-butanol ∶ water (4∶1∶5).图2　睡莲花酚类成分的高速逆流色谱Fig.2　HSCCC chromatogram of phenolic compounds from N.candida

2.2HPLC纯度检测及结构确证经HPLC分析，化合物I、II～IV的纯度分别为73.53%、92.42%、82.36%和85.65%。通过波谱技术及理化性质，并与已知对照品共薄层，Rf值一致，故确证它们的结构分别为异槲皮苷(I)、紫云英苷(II)、isostrictiniin(III)和烟花苷(IV)。

注：I .异槲皮苷，II.紫云英苷，III.isostrictiniin，IV.烟花苷。Note：I.Isoquercitrin；II.Astragalin；III.Isostrictiniin；IV.Nicotiflorin.图3　睡莲花酚类成分的HPLC色谱图Fig.3　HPLC chromatogram of phenolic compounds from N.candida

3　结论

利用HSCCC方法对雪白睡莲花提取物中的标识性酚类化合物进行了分离纯化，经过溶剂体系的优化选择，应用乙酸乙酯∶甲醇∶水(4∶1∶5)和乙酸乙酯∶正丁醇∶水(4∶1∶5)两步从雪白睡莲花提取物中分离得到了异槲皮苷、紫云英苷、isostrictiniin和烟花苷。该方法样品损失小，且能够快速从睡莲花中获得高纯度的标示性成分。试验结果可为维吾尔药睡莲花质量标准的制定及其进一步深入开发提供基础数据。

[1] 中华人民共和国卫生部中国药典委员会.维吾尔药分册[S].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1999：41.

[2] 刘勇民.维吾尔药志：下[M].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1999：541.

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[4] ZHAO J，LIU T，MA L，et al.Antioxidant and preventive effects of extract fromNymphaeacandidaflower oninvitroimmunological liver injury of rat primary hepatocyte cultures [J/OL].Evidence-based complementary and alternative medicine(2009-01-12)[2016-04-05].http：//www.doc88.com/p-3347741121785.html.doi:101093/ecam/nep003.

[5] RAJAGOPAL K，SASIKALA K，RAGAVAN B.Hypoglycemic and antihyperglycemic activity ofNymphaeastellataflowers in normal and alloxan diabetic rats[J].Pharm Biol，2008，46：654-659.

[6] 赵军，徐芳，吉腾飞，等.睡莲属植物化学成分及生物活性研究进展[J].天然产物研究与开发，2014，26(1)：141-147.

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Isolation and Purification of Phenolic Compounds fromNymphaeacandidaPresl by High-speed Counter-current Chromatography

ABUDUREYIMU Maiwylajiang1, LI Chen-yang2, LI Qian1, ZHAO Jun2*et al

(1. College of Life Sciences & Technology, Xinjiang University, Urumqi, Xinjiang 830046; 2. Xinjiang Key Laboratory for Uighur Medicines, Xinjiang Institute of Materia Medica, Urumqi, Xinjiang 830004)

[Objective] To isolate and purify phenolic constituents fromNymphaeacandidaPresl by high-speed counter-current chromatography (HSCCC). [Methods] HSCCC was employed to separate phenolic compounds fromN.candidawith two steps. Two solvent systems were ethyl acetate ∶ methanol ∶ water (4∶1∶5) and ethyl acetate ∶ n-butanol ∶ water (4∶1∶5). HSCCC was executed under the conditions of 2.0 mL/min flow rate, 850 r/min rotation speed and 254 nm detection wavelength. The purities of compounds were determined by HPLC. [Result] In the first separation step, isoquercitrin (I, 41.4 mg), astragalin (II, 40 mg) and mixtures of III and IV (85 mg) were extracted from 200 mg sample. In the second step, mixtures of III and IV were obtained: isostrictiniin (III, 50.1 mg) and nicotiflorin(IV, 26.3 mg). The purities of these compounds were determined as 73.53%, 92.42%, 82.36% and 85.65% by HPLC. [Conclusion] Phenolic compounds fromN.candidacan be quickly isolated and purified by HSCCC.

High-speed counter-current chromatography;Nymphaeacandida; Phenolic compounds

新疆维吾尔自治区科技支撑计划项目(20133318)。

买吾拉江·阿不都热衣木(1992- )，男，新疆柯坪人，硕士研究生，研究方向：药食兼用植物的研究与开发。*通讯作者，研究员，博士，硕士生导师，从事药食兼用植物的研究与开发工作。

2016-06-06

S 567.2

A

0517-6611(2016)21-107-03