无菌猪生长、血液以及脏器相关指标的测定

孙静，杜蕾，丁玉春，曹浩然，吴梦，林保忠，张世华，刘作华*，葛良鹏*

(1.重庆市畜牧科学院，重庆　402460； 2.农业部养猪科学重点实验室，重庆　402460；3.养猪科学重庆市市级重点实验室，重庆　402460； 4. 西南大学荣昌校区，重庆 荣昌　402460)



无菌猪生长、血液以及脏器相关指标的测定

孙静1，2，3，杜蕾4，丁玉春1，2，3，曹浩然1，2，3，吴梦1，2，3，林保忠1，2，3，张世华1，刘作华1，2，3*，葛良鹏1，2，3*

(1.重庆市畜牧科学院，重庆402460； 2.农业部养猪科学重点实验室，重庆402460；3.养猪科学重庆市市级重点实验室，重庆402460； 4. 西南大学荣昌校区，重庆 荣昌402460)

目的建立无菌太湖猪多项生理数据背景资料。方法对4头25d无菌猪和4头同窝普通级群体，雌雄比3∶1，测定并比较血液常规、生化、免疫球蛋白和主要脏器发育指标。运用异速生长建模，对主要脏器重量相对体重的异速生长进行了分析。结果(1)无菌猪与普通级猪的12项血常规和8项血生化指标差异有显著性(P < 0.05)；(2)无菌猪与普通级猪的平均体重、血清中IgM表达量差异达到显著性水平(P < 0.05)，且无菌猪缺少肠系膜淋巴结；(3)无菌猪的心脏、脾和胃与体重呈负异速生长(异速生长指数b<1)，肠道与体重的异速生长指数为1.78，为正异速生长；而普通级猪的心脏、胃和肠道与体重呈负异速生长(b<1)，肾与体重的异速生长指数最大，为1.20，呈正异速生长。结论微生物学等级差异影响了猪体重、血液及脏器、免疫系统的发育。

无菌猪；血液参数；脏器发育；异速生长分析

无菌动物(germ-free，GF)是以剖腹术获得、饲养在隔离器内，利用现代检查技术未能检出微生物的动物。由于多数啮齿类模型在复制大型动物的疾病的临床表现可靠性低[1]，大型无菌动物(猪)被认为是研究人类的胃肠道、免疫以及大脑发育等影响因素的首选非灵长类动物模型[2-4]。目前，无菌猪已用于肠出血性大肠杆菌感染[5]、艰难梭菌感染[6]等研究；或与菌群移植技术结合，用于研究肠道菌群与环境间关系的研究[7]。此外，无菌猪模型也被用于评估轮状病毒疫苗免疫原性和保护效果[8]。

临床前安全性评价研究结果的准确和可靠性，是保证新型药物、疫苗、益生类产品安全、有效、可控性开发的基本条件之一。但实验动物品系、个体差异、遗传背景以及实验室评估方法等存在差异，为此，建立实验室内实验动物生理指标数据背景资料必不可少。如詹纯列等[9]针对SPF小型猪开展了血液学和尿常规等指标的测定。类似地，开展无菌猪血液常规、血液生化、主要脏器生长发育等指标数据资料的收集与分析，能为以无菌猪为基础的研究与临床应用提供客观的科学依据。本研究对同日龄的无菌级猪(GF)和普通级猪(CV)的生长、血液学及血液生化指标、血液免疫球蛋白、脏器发育等多项指标进行测定，为GF猪的使用提供基础参考。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1动物

实验母猪(子宫剖腹术)：选用健康后备太湖母猪(编号346)，配种太湖公猪编号375(体重 > 200kg)，购自荣昌县树德养猪场(种畜禽生产经营许可证(渝荣)23150004)，地址为重庆市荣昌县昌州街道石河村二组。配种时间2015年8月6日，预产期为2015年11月28日。剖腹产手术时间：2015年11月23日上午11时起。无菌条件下，选出4头体重相似的无菌仔猪进入隔离器内饲喂，直至25日龄。其余15头仔猪剪耳号后，由普通级母猪(编号379)代哺至25日龄。

无菌级仔猪(GF组)：共 4头，3母1公，由重庆市畜牧科学院无菌猪培育平台提供。普通级仔猪(CV组)：25日龄时，选择4头体重相似个体(3母1公)，由重庆市畜牧科学院石河实验动物基地提供。由本实验室和重庆市荣永总医院按照GB-14926.4-2001标准，对动物粪便和生活环境标本进行检测，结果符合无菌要求。

1.1.2饲养

动物饲养在隔离系统中【SYXK(渝)2011-0001】，洁净度为100级[10]，室温22℃～28℃，湿度40%～70%，光照12h/d，动物自由采食和饮水。配方奶粉由60Co-γ线源辐照灭菌、饮用酸化水经高温高压灭菌处理(pH=2～3)。同窝4头普通级仔猪饲养在普通级动物房，日常饲养管理遵循猪场内制度施行。

1.2方法

1.2.1样品采集

采样前12h，动物禁食不禁水，前腔静脉采血。抗凝剂使用情况为：血常规测定(EDTA-K2抗凝管)、血生化指标测定(肝素钠抗凝管)、血中免疫球蛋白IgA、IgG和IgM(无抗凝剂)。其中，血常规和血生化测定由重庆市永荣总医院当天完成测定(BC-6900全自动五分类血细胞分析仪，深圳迈瑞；AU-680全自动生化分析仪，贝克曼公司)，按照该医院血液检测实验室相关标准操作规程进行检测。

免疫球蛋白测定：Elx50微孔板全自动洗板机(BioTek)、Epoch微孔板分光光度计(BioTek)；测定使用试剂盒为IgA(Pig)ELISAkit(KA2038)、IgM(Pig)ELISAKit(KA2039)、IgG(Pig)ELISAkit(KA2016)，Abnova公司。

1.2.2测定指标

血常规指标：白细胞总数(WBC)、中性粒细胞百分比(Neu%)、淋巴细胞百分比(LYM%)、单核细胞百分比(MON%)、嗜酸性粒细胞百分比(Eos%)、嗜碱性粒细胞(BAS%)、中性粒细胞数目(NEU)、淋巴细胞数目(LYM)、单核细胞数目(MON)、嗜酸性粒细胞(EOS)、嗜碱性粒细胞(BAS)、红细胞数目(RBC)、血红蛋白浓度(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞分布宽度变异系数(RDW-C)、红细胞分布宽度标准差(RDW-S)、血小板(PLT)、平均血小板体积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)、血小板容积(PCT)。

血生化指标：谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、谷氨酰氨基转移酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)、谷草转氨酶/谷丙转氨酶(AST/ALT)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、白球比(A/G)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、间接胆红素(IDBIL)、胆碱酯酶(CHE)、尿素(BUN)、肌酐(CREA)、尿酸(UA)、总胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、全程C反应蛋白(CRP)、葡萄糖(GLU)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)。

1.2.3猪脏器测定

放血处死后立即解剖，分离心、肝、脾、肺、肾、胃、肠道、淋巴结等脏器称湿重，并计算其脏器指数。器官指数(g/kg)=各器官湿重/仔猪体重 × 100%。

异速生长方程：Y=aXb，其中X为体重，Y为各器官重量，a表示异速生长常数，b表示异速生长指数；X与Y之间的关系主要取决于b值的大小[11, 12]。

1.3数据整理与分析

Excel统计分析各指标的测定值，计算每个表型性状的平均值±标准差。T检验进行GF猪与CV猪各性状的差异显著性分析。

异速生长模型以幂函数方程(Y=aXb)计算，并以相关指数R2最大及残差平方和最小最小作为曲线拟合标准，并求出器官重与体重的拐点。

Excel对猪IgA、IgM和IgG标准品拟合标准曲线，计算IgA、IgM和IgG的浓度；T检验比较在GF猪与CV猪血清中浓度差异。

2　结果

2.1GF猪与CV猪的血液学检查结果

2.1.1血常规测定结果

比较发现，GF猪多项血液学指标与CV猪差异有显著性(见表1)。其中，在WBC、MON与MON%、EOS与EOS%、BAS与BAS%、HGB、HCT、RBC、PCT、PLT这12项血常规指标上，GF猪低于CV猪(P<0.05)。血液中仅LYM、MCV、MCH、MCHC、RDW-S、RDW-C指标上，GF猪与CV猪差异无显著性(P>0.05)。和猪血常规参考值相比，GF猪血液的HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC都低于猪的参考值范围；PLT指标上，GF猪与与CV猪差异达到显著水平(P=0.04)，且高于猪参考值。无论肠道内是否存在微生物，25日龄太湖猪在MON、MON%、PDW指标上都明显高于2～6月龄太湖猪。

表1　25日龄GF猪与CV猪的血常规指标比较

注：/表示在医院检查报告单上未显示该参考值。*表示为2～6月龄太湖猪(性别不限)的血常规测定值，引用至《太湖猪实验动物化的初步研究——太湖猪血液生理指标测定与分析》[13]。

Note. /representsnoreferencevalueshownintheMedicalExaminationReportbytheHospital.*Thehematologicalparametersof2-to6-month-oldpigs,whichwerecitedfromthejournalarticlePreliminary research on experimental animalization of Taihu pig-Detection and analysis of blood physiological parameters in Taihu pig[13].

2.1.2猪血液生化指标测定

在测定的25项血生化指标中，CV猪血清中ALT、GGT、ALP含量高于CV猪血清内含量(P<0.05)；而TP、ALB、GLO、BUN、UA、CHOL、TG、HDL这8项指标在GF猪血清内含量低于CV猪，差异有显著性(P<0.05，见表2)。

2.1.3猪血清免疫球蛋白测定

血清中IgA、IgG、IgM测定结果(见表3)显示，GF猪血清中IgA和IgG表达量分别为(399.48±71.59)ng和(1406.60±146.78)ng，高于CV猪的表达量(P<0.05)；CV猪血清中IgM表达量则高于GF猪，为(142.52±13.55)ng(P<0.05)。

表2　25日龄GF猪与CV猪各血液生化指标的比较

表3　ELISA检测无菌猪血清中IgA、IgG和IgM的含量

注：*ELISA抗体检测结果显示IgA和IgG表达量在无菌猪和普通级猪两组间差异分别达到显著性水平(P<0.05)，而无菌猪血清中IgM表达量低于普通级猪，且差异达到显著性水平(P<0.05)。

Note.*TheresultofELISAantigendetectionshowedthattheexpressionofIgAandIgGintheserumbetweenGFgroupandCVgrouphadasignificantdifference(P<0.05),whiletheexpressionofIgMintheserumbetweenGFpigletswassignificantlylowerthanthatinCVpiglets’serum(P<0.05).

2.2猪脏器指标测定

主要脏器称重结果显示，GF猪平均活体重为(2.61±0.42)kg，CV猪平均活体重为(4.82±0.69)kg，两组间活体重差异达到极显著(P<0.01)。GF猪平均体长为(34.50±3.53)cm、胸围为(32.25±3.01)cm，低于CV猪平均体长(45.50±3.00cm，P<0.01)和胸围(38.25±1.50)cm，且差异达显著水平(P<0.05)。

各项脏器湿重中，GF猪与CV猪差异存在显著性(P<0.05)，尤其体现在心肺、胃、肠道湿重上。比较脏器指数发现，GF猪心肺指数、肝指数、脾指数以及胃指数与CV猪差异无显著性(P > 0.05)。GF猪与CV猪的肾指数差异达到显著性水平(P<0.05)，而肠指数差异达到极显著水平(P=0.02)。

表4　GF猪与CV猪各个脏器指标的测定

注：肠道包括十二指肠、空肠、回肠、结肠和直肠的总重量。/ 表示对应的项目不存在拟合公式。

Note.Gutrepresentsthetotalwetweightofduodenum,jejunum,ileumandcolon. /Noallometricequationforthecorrespondingindex.

注：A：普通级(CV)猪肠内肠系膜淋巴结明显存在；B：无菌级(GF)猪缺乏肠系膜淋巴结。图1　不同微生物学等级影响猪肠内肠系膜淋巴结的存在Note. A: Mesenteric lymph nodes are present in a gut of CV pig; B: No mesenteric lymph node is observed in a GF pig.Fig.1　Different microbiological background affected the presence of mesenteric lymph nodes in the gut of Taihu piglets

从表4中分析可知GF猪的内脏器官的早熟性顺序是：脾 > 胃 > 心肺 >肝 > 肾 > 肠道。若以异速生长系数b值为准，则无菌猪的心肺、脾和胃属早熟的器官，肝属中熟器官，而肾和肠道则属晚熟的器官。而CV猪内脏器官的早熟性顺序为：心肺 > 肠道 > 胃 > 脾> 肝 > 肾。同样地，CV猪的心肺、胃和肠道为早熟的器官，肝和脾则为中熟的器官，肾为晚熟的器官。另外，微生物学质量等级影响了猪肠系膜淋巴结的存在。25日龄无菌猪肠道内缺少肠系膜淋巴结，而CV猪肠道内肠系膜淋巴结明显存在(见图1)。

3　讨论

3.1无菌状态对仔猪血液指标的影响

大型无菌动物模型与粪便移植技术共同推动菌群与人和动物疾病的研究。因此，获得无菌猪、建立其血液学参考指标是本单位无菌猪培育平台现阶段研究重点。实验动物血液学参数能反映机体各组织、器官的功能状态。一旦机体既能出现问题，亦会在血液上反映出来。血常规作为疾病诊断的必要检测手段之一。表1数据显示，GF猪血液中多项检测指标都显著低于同窝、同日龄CV猪；仅在LYM、MCV、MCH、MCHC、RDW-SY指标上未出现明显差异。

值得注意，GF猪和CV猪血液中多项指标都未在猪和人的参考值范围内。这除了与医院的检测仪器、试剂和检测方法有关外，也与猪品种等因素有关，也提示我们仅靠现有的猪血液参考值并不能有效地反映GF猪组织、器官的功能状态。因此，在GF猪的培育过程中，及时完整地收集每批次动物血常规和血生化指标，建立GF猪血液学参数是基础而重要工作之一。

血液生化指标是动物机体代谢过程的内在反映，可作为检测机体健康、生产性能以及适应性的重要参考依据。表2数据可知，25日龄GF猪血清中ALT、GGT和ALP含量高于CV猪血清，差异达到显著性水平(P<0.05)，而在TP、ALB、GLO、BUN、UA、CHOL、TG、HDL这8项指标上与CV猪存在显著性差异。研究指出，尿素是氨基酸代谢的最终产物，血清中尿素含量主要受蛋白质摄入量和肝分解代谢能力的影响[14]。GF猪血清尿素含量显著低于同日龄CV猪以及断奶阶段CV猪[15, 16]，这说明GF猪对蛋白质的代谢能力低于CV猪，且可能受年龄的影响小。血清中GLO指标反映了机体抗病力，降低则易受肠道病原微生物的侵袭。GF猪血清中GLO显著低于CV猪，这表明无菌状态下仔猪的自身防御能力低。这与本次实验结果显示GF猪肠系膜淋巴结缺失的结果(见图1)相吻合。

3.2无菌状态对猪血液中免疫球蛋白表达量影响

新生仔猪血清与初乳中都含有低数量的免疫球蛋白，代表了它们建立在抵抗自身抗原的多特异性和反应性基础上的未免疫抗体组库[20]。Markowska-Daniel等[21]检测发现，10日龄仔猪血清中IgA、IgM和IgG浓度已达到毫克级别，且可能与提高仔猪自身免疫有关。本次试验中，25日龄GF猪和CV猪血清中，三种免疫球蛋白的含量均在纳克级别，仅IgG浓度达到了微克级别。这说明血清内免疫球蛋白浓度与猪品种有关。而GF猪血清内IgA和IgG浓度高于CV猪(P<0.05)，IgM量低于CV猪血清，差异达到显著性水平(P<0.05)。杜凌等[22]测定出1段婴儿配方奶粉中IgG含量为45.90mg/100g奶粉。而本试验整个无菌猪培育过程都采用婴儿奶粉(0-6月龄)作为保证动物生长的营养基础，这很可能是GF猪血清中相对高含量免疫球蛋白的原因之一。

而肠道菌群会刺激保护性免疫应答反应，以确保宿主-微生物互利共生。因此肠道共生菌群的存在使得黏膜免疫动态研究成为难题。IgA是哺乳类动物黏膜表面分泌的主要抗体，尤其在肠道内。Hapfelmeier等[23]利用无菌小鼠发现了高特异性抗共生IgA反应，而菌群定植小鼠则快速消除了这一反应。这可能也是解释本实验中GF猪血清中较高表达量免疫球蛋白存在的原因之一。

3.3无菌状态对猪器官发育的影响

动物的脏器重量和脏器指数可一定程度体现其功能的强弱。同日龄的GF猪无论在体长、胸围还是体重等生长指标上，都显著低于CV猪。而这一情况同样反映在了各脏器的发育上，尤其表现在心肺、胃和肠道的发育。研究认为内脏器官的发育早晚直接影响其他部位的生长发育快慢。一般，体重相近动物，心脏大小和重量与运动量有关。异速生长系数b显示，GF猪的内脏器官中肠道是晚熟的器官，而在CV猪上则为早熟的器官；脾在GF猪上表现为早熟的器官而在CV猪上为中熟的器官。研究指出细菌对动物的免疫器官发育具有刺激调节作用[24]。由此可见，微生物学等级差异影响了猪内脏器官发育的早熟性顺序，尤其是与免疫有关的脏器。

无菌猪在菌群与疾病、营养、代谢等关系研究均有广泛的应用前景。因此，在国内建立以GF猪资源开发及技术服务为导向的无菌猪工程中心是整个课题组共同的目标。本次研究测定表明了在生长、血液以及内脏器官等多个发育指标上，GF猪与CV猪都存在显著差异。

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Measurement of body weight, blood parameters and mainorgancoefficientsofgerm-freepiglets

SUNJing1，2，3,DULei4,DINGYu-chun1，2，3,CAOHao-ran1，2，3,WUMeng1，2，3,LINBao-zhong1，2，3,ZHANGShi-hua1,LIUZuo-hua1，2，3*，GELiang-peng1，2，3*

(1.ChongqingAcademyofAnimalScience, 2.KeyLaboratoryofPigIndustryScienceofAgricultureMinistry,3.ChongqingKeyLaboratoryofPigIndustryScience,RongchangChongqing402460,China;4.DepartmentofAnimalNutritionandFeedScience,SouthwestUniversityRongchangCampus,RongchangChongqing402460)

ObjectiveToestablishthebackgroundinformationofphysiologicalparametersforgerm-free(GF)Taihupiglets.MethodsInthisstudyweselected25daysoldGFTaihupigletsand4conventional(CV)littermates,themaleandfemaleratiowas1∶3,tomeasurethenormalclinicalvaluesofhematologyandserumbiochemistry,immunoglobulinconcentrationandmainorgancoefficients.TheanalysisofrelativegrowthsofmainorganweighttobodyweightwasconductedintheTaihuGFandCVpigsbyallometricscalingmodel.Results(1)Twelvehematologicalparametersand8bloodbiochemicalparametersintheGFpigletsweresignificantlylowerthanthoseinCVpigs(P<0.05). (2)Theaveragebodyweight,IgMconcentrationofGFpigsandCVpigshadsignificantdifference(P<0.05),andnomesentericlymphnodeswerefoundintheGFpigs. (3)ThegutweighthadthelargestallometricassociationwithbodyweightintheGFpigs,whilespleenweighthasthelargestallometricassociationwithbodyweightintheCVpigs.BoththeweightofheartandstomachinCVandGFpigshadanegativeallometricassociationwithbodyweight(allometriccoefficientb<1),respectively.ConclusionsDifferentmicrobecontrolgradesaffectthebodyweight,hematologyandserumbiochemistry,expressionofimmunoglobulinanddevelopmentofmainorgansinlaboratorypigs.

Germ-freepig；Hematologicalparameters;Organcoefficient;Allometricanalysis

GELiang-peng,E-mail:geliangpeng1982@163.com；LIUZuo-hua,Email:liuzuohua66@163.com

国家“863”计划(2014AA021602)；重庆市国际合作项目(CSTC2013gjhz80002)；重庆市基础与前沿研究(cstc2013jcyjC80001)；重庆市农发资金(12402)资助项目；无菌动物应用示范平台(cstc2015pt-kjyfsf0024)。

孙静(1985-)，女，博士，肠道微生物，研究方向：无菌动物的培育与应用。E-mail：sunjing85026@163.com

葛良鹏(1982-)，男，研究员，研究方向：动物资源创新开发利用。E-mail:geliangpeng1982@163.com；刘作华，男，研究员，研究方向：地方猪资源保护与开发利用。

研究报告

Q95-33

A

1005-4847(2016)04-0388-07

10.3969/j.issn.1005-4847.2016.04.010

2016-01-28