PCI-neo-肝细胞生长因子对脂多糖刺激的大鼠肾小球系膜细胞α-平滑肌肌动蛋白表达的影响

王红月，张　洋，刘　丽，顾春梅

(吉林大学第一医院 肾内科，吉林 长春130031)



PCI-neo-肝细胞生长因子对脂多糖刺激的大鼠肾小球系膜细胞α-平滑肌肌动蛋白表达的影响

王红月，张洋，刘丽，顾春梅*

(吉林大学第一医院 肾内科，吉林 长春130031)

目的探讨PCI-neo-肝细胞生长因子 (PCI-neo-HGF) 对脂多糖(LPS)刺激的大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达是否有抑制作用，以及这种抑制作用是否与对转化生长因子-β1(TGF-β1)表达的抑制有关。方法体外培养GMCs并分为5组，(1)Ctrl：对照；(2) C+L：GMCs+ LPS(10 μg/ml)；(3)C+L+P-n:GMCs+LPS(10 μg/ml)+ PCI-neo(2 μg)；(4)C+L+P-n-H2：GMCs+LPS(10 μg/ml) +PCI- neo-HGF(2 μg)；(5)C+L+P-n-H8：GMCs+ LPS(10 μg/ml)+PCI-neo-HGF(8 μg);用RT-PCR的方法测定α-SMA及β-actin mRNA的表达,用Western方法检测及α-SMA,TGF-β1及β-actin的蛋白表达。结果与Ctrl 组相比，C+L及C+L+P-n 组α-SMA mRNA及蛋白表达增多(P<0.05)，TGF-β1蛋白表达增多(P<0.05)；与C+L相比，C+L+P-n-H2及C+L+P-n-H8组α-SMA mRNA及蛋白的表达均减少(P<0.05)，TGF-β1蛋白的表达减少(P<0.05)。与C+L组比较，加入TGF-β1抑制剂组α-SMA 蛋白表达水平下降(P<0.05)。结论PCI-neo-HGF可抑制LPS刺激的GMCs的α-SMA 的mRNA及蛋白表达，且这种抑制作用可能与其对TGF-β1表达的抑制有关。

肝细胞生长因子；肾小球系膜细胞；α-平滑肌肌动蛋白；转化生长因子-β1

(ChinJLabDiagn,2016,20:1264)

慢性肾脏病是严重危害人类健康的疾病，在它的进展过程中有很多机制参与其发病，如系膜细胞的过度增生、细胞外基质的过度沉积[1]等。肝细胞生长因子(HGF)对肾脏的保护作用有很多研究，目前认为其可通过加速细胞外基质的降解[2]，阻断小管上皮细胞转分化及促进细胞增殖[3，4]等实现对肾脏的保护作用。目前研究认为α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)是肾小球性损伤中扮演重要角色。关于HGF对肾小球系膜细胞(GMCs)α-SMA表达的影响尚不明确，本研究主要探讨HGF对脂多糖(LPS)刺激的大鼠GMC的α-SMA的表达是否有抑制作用，以及这种抑制作用是否与对转化生长因子-β1(TGF-β1)表达的抑制有关。

1　材料与方法

1．1大鼠GMC的培养及质粒转染将对数生长期的大鼠肾小球系膜细胞进行传代培养，第4代用于实验，质粒采用脂质体转染法，于转染后48 h收集细胞备用。LPS在转染之前6小时加入。TGF-β1抑制剂在加入脂多糖后4小时加入。

1.2分组将传代培养的GMC分为如下5组： (1)Ctrl：对照；(2) C+L：GMCs+ LPS(10 μg/ml)；(3)C+L+P-n:GMCs+LPS(10 μg/ml)+PCI-neo(2 μg)；(4)C+L+P-n-H2：GMCs+ LPS(10 μg/ml) +PCI-neo-HGF (2 μg)；(5)C+L+P-n-H8：GMCs+ LPS(10 μg/ml)+ PCI-neo-HGF(8 μg)。加入TGF-β1抑制剂后分2组：(1)C+L：GMCs+LPS(10 μg/ml)；(2)C+L+i-T-β1：GMCs+LPS (10 μg/ml)+ TGF-β1抑制剂(8 μg)。

1.3α-SMA mRNA的表达

采用RT-PCR的方法检测，首先提取RNA，合成cDNA，计算RNA浓度。PCR扩增α-SMA基因，β-actin为内参。PCR特异性引物及扩增条件见表1。PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳后，用Phoretix ID凝胶图像分析软件测定电泳条带的吸收度，用内参校准。

表1　PCR特异性引物及扩增条件

1.4TGF-β1及α-SMA蛋白水平

用Western印记法检测。转染后48 h的细胞加入细胞裂解缓冲液，离心，提取总蛋白，测定蛋白含量电泳、移膜，封闭。加入一抗、二抗室温孵育1 h。晾干拍照。应用ECL化学发光试剂在X线胶片上曝光、显影和定影。测定TGF-β1及α-SMA蛋白表达条带的灰度值，用β-actin作为内参，计算比值。

2　结果

2.1各组 GMC的α-SMA mRNA及蛋白的表达

48 h时PCI-neo-HGF对LPS刺激的GMC的α-SMA 的mRNA表达及半定量分析(图1，A、B),蛋白表达及半定量分析(图1，C、D)。与Ctrl 组相比，C+L及C+L+P-n 组α-SMA mRNA及蛋白表达明显增多(P<0.05)，C+L及C+L+P-n两组无统计学差异(P>0.05)，说明LPS可刺激GMC α-SMA mRNA及蛋白的表达，而PCI-neo对α-SMA的表达无影响；与C+L相比，C+L+P-n-H2及C+L+P-n-H8组α-SMA mRNA及蛋白的表达均减少，说明PCI-neo-HGF对LPS刺激的GMC的α-SMA的表达有抑制作用，且随着剂量的增加抑制作用增强。

2.2各组 GMC的TGF-β1蛋白的表达

48 h时PCI-neo-HGF对LPS刺激的GMC的TGF-β1蛋白表达及半定量分析(图2)。与Ctrl 组相比，C+L及C+L+P-n 组TGF-β1蛋白表达明显增多(P<0.05)，C+L及C+L+P-n两组无统计学差异(P>0.05)，说明LPS可刺激GMC TGF-β1蛋白的表达，而PCI-neo对TGF-β1的表达无影响；与C+L相比，C+L+P-n-H2及C+L+P-n-H8组TGF-β1蛋白的表达均减少，说明PCI-neo-HGF对LPS刺激的GMC的TGF-β1的蛋白表达有抑制作用，且随着剂量的增加抑制作用增强。与PCI-neo-HGF对α-SMA蛋白表达抑制作用趋势一致。

注：A)、B) 各组α-SMA mRNA的表达(RT-PCR);C)、D)各组α-SMA蛋白的表达(Western blot)。 与Ctrl组比较，*P<0.05，与C+L组比较，#P<0.05。

图1LPS刺激后各组α-SMA mRNA及蛋白表达

注： 与Ctrl组比较，*P<0.05，与C+L组比较，#P<0.05。

2.3TGF-β1抑制剂对LPS 刺激的GMC α-SMA 表达的影响

在48 h时，TGF-β1抑制剂对LPS 刺激的GMC α-SMA 蛋白表达及半定量分析(图3)。与C+L组比较，加入TGF-β1抑制剂组α-SMA 蛋白表达水平明显下降。由此得出，TGF-β1抑制剂能抑制LPS刺激的GCM α-SMA的表达。也就是说，LPS诱导后GMC α-SMA表达的升高与TGF-β1表达升高有关。

注：与C+L 组比较 #P<0.05。

3　讨论

LPS可刺激肾小球系膜细胞的增生，且研究认为PCI-neo-HGF可抑制LPS刺激的肾小球系膜细胞的增生，而且这用抑制作用与对TGF-β1的抑制有关[5]。

本研究结果显示，LPS可刺激GMC的α-SMA 的mRNA及蛋白表达，而PCI-neo-HGF可抑制LPS刺激的GMC的α-SMA 的mRNA及蛋白表达，且随着剂量的增加抑制作用增强。α-SMA诱导的系膜细胞活化是基质沉积、肾小球硬化性损伤的重要环节[6]，由此得出HGF可通过对肾小球系膜细胞α-SMA表达的抑制而实现对肾脏的保护。我们研究也显示，PCI-neo-HGF可抑制脂多糖刺激的肾小球系膜细胞TGF-β1蛋白的表达。进一步研究HGF对α-SMA表达的抑制是否与其抑制TGF-β1的表达有关，我们在LPS刺激的GMC中加入TGF-β1抑制剂，观察到α-SMA的表达明显下降，由此我们得出，HGF对LPS刺激的肾小球系膜细胞α-SMA的抑制作用与其对TGF-β1表达的抑制有关。

[1]Grupp C,Troche I,Klass C,et al.A novel model to study renal myofibroblast formationin vitro[J].Kidney Int,2001,59(2):543.

[2]Dai C,Liu Y.Hepatocyte growth factor antagonizes the profibrotic action of TGF-beta 1 in mesangial cells by stabilizing Smad transcriptional corepressor TGIF[J].J Am SocNephrol,2004,15(6):1402.

[3]Li Y,Yang J,Dai C,et al.Role for integrin-linked kinase inmediating tubular epithelial tomesenchymal transition and renal intersttial fibrogenesis[J].J Clin Invest,2003,112(4):503.

[4]Weidong Wang,Chunling Li,et al.Role of AQP1 in endotoxemia-induced acute kidney injury[J].Am J Physiol Renal Physiol,2008,294:1473.

[5]王红月，顾春梅，崔明姬.PCI-neo-肝细胞生长因子对大鼠肾小球系膜细胞增生及对转化生长因子β1表达的影响[J].中华肾脏病杂志，2011，27(5)：376.

[6]Chunsun Dai,Junwei Yang,Sheldon Bastacky,et al.Intravenous Administration of Hephtocyte Growth Factor Gene Ameliorates Diabetic Nephropathy in Mice[J].J Am Soc Nephrol,2004,15(10):2637.

The Effects of PCI-neo- HGF on the express of α-SMA in rat glomenrulus mesangial cells stimulated by LPS

WANG Hong-yue，ZHANG Yang，LIU Li，et al.

(DepartmentofNephrology,FirstHospitalofJilinUniversity,Changchun130031，China)

ObjectiveTo inquire whether PCI-neo-hepatocyte growth factor (HGF) could inhabit the express of α-smooth muscle actin (α-SMA) in rat glomenrulus mesangial cells (GMCs) stimulated by lipopolysaccharide (LPS),and whether this effect was associated with transforming growth factor-β1 (TGF-β1).MethodsGMCs were divided into the following groups:Ctrl:control;C+L:GMCs+ LPS(10 μg/ml);C+L+P-n:GMCs+LPS(10 μg/ml)+PCI-neo(2 μg);C+L+P-n-H2：GMCs+LPS(10 μg/ml)+PCI-neo-HGF(2 μg);C+L+P-n-H8：GMCs+LPS(10 μg/ml)+PCI-neo-HGF(8 μg).α-SMA and β-actin mRNA expressions were detected by RT-PCR.The protein expressions of α-SMA,β-actin and TGF-β1 were detected by Western.ResultsCompared with Ctrl group,the mRNA and protein expresses of α-SMA increased (P<0.05),and the protein express of TGF-β1 increased(P<0.05)in C+L group and C+L+P-n group.Compared with C+L group,the mRNA and protein expresses of α-SMA increased (P<0.05),and the protein express of TGF-β1 increased(P<0.05)in C+L+P-n-H2 group and C+L+P-n-H8 group.Compared with C+L group,the express of α-SMA protein decreased in adding inhibition of TGF-β1 group(P<0.05).ConclusionPCI-neo-HGF could inhibit mRNA and protein expresses of α-SMA in rat GMCs stimulated by LPS,and this effect maybe was associated with inhibiting TGF-β1.

Hepatocyte growth factor;Glomenrulus mesangial cells; α- smooth muscle actin;transforming growth factor-β1

吉林省卫生厅基金(2009ZC041)

1007-4287(2016)08-1264-04

Q51

A

2015-12-21)