儿童下呼吸道感染流感嗜血杆菌的分离及耐药性分析

王萍 强鑫华 周丽华

儿童下呼吸道感染流感嗜血杆菌的分离及耐药性分析

王萍 强鑫华 周丽华

目的 测定流感嗜血杆菌（HIN）在痰标本的阳性率及药敏分析，为临床经验治疗HIN儿童下呼吸道感染提供实验室的参考依据。方法 收集小儿肺炎患儿痰标本2056份，用API-NH进行菌种鉴定，嗜血杆菌和布兰汉菌药敏试剂盒ATB-HAEMO药敏试验，同时头孢硝噻吩纸片法检测β- 内酰胺酶。结果 2056份痰标本镜下筛查合格标本802份，标本合格率39.01%。802份合格标出中分离到HIN257株，合格痰标本分离阳性率12.05%，产酶株占52.92%，未发现β-内酰胺酶阴性耐氨苄西林（BLNAR）和β- 内酰胺酶阳性耐阿莫西林/棒酸（BLPACR）的菌株。结论 HIN耐药主要集中在氨基青霉素 和氯霉素及磺胺药物上，头孢二、三代抗菌药物、利福平及β-内酰胺/酶抑制剂、阿奇霉素具有极佳的抗菌活性，产β- 内酰胺酶是流感嗜血杆菌对氨苄西林的主要耐药机制。

流感嗜血杆菌 药敏试验 下呼吸道感染 β一内酰胺酶

除肺炎链球菌（SP）之外，流感嗜血杆菌（HIN）是引起儿童细菌性下呼吸道感染的常见的主要致病菌［1］，有研究表明感染流感嗜血杆菌的儿童占全部感染该菌人群的20%。随着β-内酰胺类抗生素的普遍应用，HIN的耐药性也受到广泛关注。本文回顾性分析2012年1月至2014年12月下呼吸道感染儿童的临床资料，为临床治疗提供实验室参考依据。

1 临床资料

1.1 菌株来源 2012年1月至2014年12月本院小儿肺炎诊断标准的住院首日患儿送检的呼吸道痰标本中分离的HIN 257株。

1.2 方法 （1）标本采集处理及细菌鉴定：按照《微生物检验操作规程》（第三版）入院当天抗生素使用前一次性吸痰管负压抽吸采集痰标本及时送检，送检的痰标本先行涂片镜检：以鳞状上皮细胞＜10个/低倍镜视野、白细胞＞25个/低倍镜视野的标本作为合格标本，筛选后的合格痰标本接种于哥伦比亚血和含万古霉素巧克力平皿，35℃，CO2孵育18～24h。巧克力平皿可疑菌落用MH平板做V、X、X+V因子需求试验，在MH平板上V因子、x因子纸片周围不生长，仅在V+X因子纸片周围生长初步鉴定为HIN，再行APINH菌种鉴定。X、V、X+V纸片为英国OXOID公司产品。（2）β-内酰胺酶检测：用Cefinase纸片（生物梅里埃公司）按说明书测定被试菌株的β-内酰胺酶。（3） 药敏试验：采用法国梅里埃公司生产的嗜血杆菌和布兰汉菌药敏试剂盒（ATB-HAEMO）进行药敏试验，操作严格按照说明书进行。质控菌株为流感嗜血杆菌ATCC49247。

1.3 统计学方法 药敏试验结果采用wHONET 5.6统计软件进行分析。

2 结果

2.1 流感嗜血杆菌阳性检出率 2056份痰标本中，镜下筛查合格标本802份，标本合格率39.01%。802份合格标出中分离到HIN 257株，合格痰标本分离阳性率12.50% ，高于肺炎链球菌在儿童呼吸道疾病的病原菌中居首位。

2.2 HIN的季节分布 HIN全年均可能导致儿童感染，春、夏、秋、冬四季分离率分别为：46.30%、13.23%、10.12%、30.35%。其中以每年2～4月份冬春交替季节间检出率最高占51.75%，与其它季度比较差异有统计学意义。见图1。

图1 2012-2014年间不同月份儿童下呼吸道HIN的分离株数

2.3 β-内酰胺酶检测结果 257株HIN共检测到136株β-内酰胺酶阳性菌株，产酶株占52.92%。未发现BLNAR（β-内酰胺酶阴性而氨苄西林耐药）和BLPACR（β- 内酰胺酶阳性而阿莫西林/棒酸耐药）的HIN。

2.4 HINβ-内酰胺酶产酶株和非产酶株的药敏结果 HIN产酶株和非产酶株的药敏结果除氨基青霉素之外，耐药主要集中在氯霉素和磺胺药物上，阿莫西林/克拉维酸、头孢呋辛、头孢噻肟、利福平、氧氟沙星及四环素对流感嗜血杆菌均表现为高度敏感，见表2。

表2 产酶与非产酶HIN对9种抗菌药物的药敏结果（%）

3 讨论

小儿呼吸系统发育不完善，气管、支气管管腔狭窄，纤毛运动差、清除能力弱，加之免疫系统发育未健全，对携带的HIN缺乏抵抗力，是婴幼儿HIN引起呼吸道感染率高的原因［2］。此外，本资料显示，不同季节呼吸道感染患儿HIN的分离率不同，以每年2～4月份冬春交替季节间检出率最高，与地域江南春夏之交气候变化大，易发生HIN呼吸系统疾病相关，可为流行病学调查及临床抗感染治疗提供有用信息。

HIN是“HACEK”菌群成员，属于苛养性细菌，生长需要V X 特殊营养物质，对检验人员的技术水平有特定要求，加上痰标本受上呼吸道正常菌群的干扰，其分离培养较为困难，临床上经常出现漏检，因此，对嗜血杆菌苛氧菌的分离鉴定和药敏试验不仅是临床迫切的需要，同时也是衡量微生物实验室技术水平的重要标志［3］。

作者认为提高HIN检出率应：（1）尽量在使用抗菌药物前留取合格的痰标本。（2）痰涂片革兰染色镜检，对标本进行培养前质量筛查，合格标本寻找WBC内吞噬的革兰阴性球菌、球杆菌，是对病原菌进行快速诊断的简易手段。（3）选择适合的含万古霉素的巧克力培养基，其富含x、V因子，且能抑制革兰阳性球菌生长，接种后置于含5% ～10%CO2的培养箱内，箱内需保持一定的湿度。（4）对照痰格兰染色涂片，识别可疑菌落为巧克力平皿上湿润、1～2mm、圆形、光滑、半透明、无色至灰白色、有光泽、易乳化，散发出类似“鼠穴”气味。菌落识别时检验人员的经验非常重要，必要时，进行革兰染色，其对确认菌落有帮助。（5）卫星试验，血平皿卫星生长，MH上不生长或MH平板做V、X、X+V因子需求试验，在MH平板上V因子、x因子纸片周围不生长，仅在V+X因子纸片周围生长是常规实验室推荐初步筛查HIN的简易方法［4］。HIN的痰涂片、巧克力平皿生长菌落和因子需求试验结果。见图1。

图2 HIN的痰涂片（A）、巧克力平皿生长菌落（B）和因子需求试验（C）结果

本资料结果显示，HIN耐药主要集中在氨基青霉素和氯霉素及磺胺药物上。HIN对氨苄西林耐药的主要机制主要是：（1）菌株产生质粒介导的TEM-1型或其他少见的ROB型β- 内酰胺酶，可以通过头孢硝噻吩纸片法来检测，若阴性氨苄西林和阿莫西林及其他β- 内酰胺类抗菌药物敏感，若阳性则报告氨苄西林和阿莫西林耐药。（2）产生染色体介导的菌株细胞壁上一种或多种青霉素结合蛋白PBP发生改变，引起青霉素结合蛋白与靶位亲和力的降低，其次是由于外膜蛋白改变导致对氨苄西林耐药，称为BLNAR菌株，此时头孢硝噻吩纸片法β- 内酰胺酶检测阴性，无论体外药敏结果如何，对阿莫西林/棒酸、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他巴唑、头孢尼西、头孢孟多、头孢克罗、头孢呋辛、头孢丙烯等β- 内酰胺类抗生素均报道耐药。本组监测中，HIN产酶株占52.92%，未发现BLNAR和BLPACR罕见菌株，显示产TEM-I型β-内酰胺酶是HIN对氨苄西林耐药的主要机制，与相关报道一致［5］，但产酶率有地区差异［6］。本资料结果显示，HIN耐药率较高的药物除复方新诺明和氯霉素外对头孢二、三代抗菌药物、利福平及β-内酰胺/酶抑制剂具有极佳的抗菌活性可为临床治疗儿童感染HIN的一线药物［7，8］，特别是阿奇霉素兼有抗非典型病原体（肺炎支原体、肺炎衣原体和军团菌属等）活性，以及对流感嗜血杆菌的抗菌活性，被推荐为社区获得性肺炎及其他呼吸道感染经验治疗的首选经验用药，无需报告常规药敏结果。

1 Shen，XZ，Lu，Q，Deng，L et a1.Resistance of Haemophi1us—inf1uenzae iso1ates in chi1dren under 5 years o1d with acute respira—tory infections in China between 2000 and 2002.The Journa1 of Internationa1 Medica1 Research，2007，35（4）：554.

2 胡亚美，江载芳，诸福棠，等.实用儿科学.第7版.北京：人民卫生出版社，2002：1167～1195.

3 张秀珍，朱德妹.临床微生物检验问答.北京：人民卫生出版社，2008：194～200.

4 陈东科，孙常贵. 实用临床微生物学检验与图谱. 北京：人民卫生出版社，2011：469～478.

5 桂和翠，王中新，沈继录.48株流感嗜血杆菌耐药性分析及B-内酰胺酶基因检测. 安徽医科大学学报，2012，（47）：56～59.

6 杨晓华， 谭 南，林爱心，等.儿童呼吸道流感嗜血杆菌的耐药性分析中国感染与化疗杂志. 2014（14）：436～439.

7 马越，李景云，金少鸿，等.细菌耐药性监测分析中应注意的问题.中国抗生素杂志，2005，30（12）：762～69.

8 程薇，钱利强，华春珍，等.儿童呼吸道标本分离的流感嗜血杆菌耐药模式研究.检验医学，2010，25（3）：192～194.

·病例报告·

313000 浙江省湖州市第一人民医院检验科