金匮肾气丸对糖尿病大鼠肾脏细胞Bax Bcl-2表达的影响

姚颖莎 何敏菲 方慧倩 郑燕 张跃明★

金匮肾气丸对糖尿病大鼠肾脏细胞Bax Bcl-2表达的影响

姚颖莎 何敏菲 方慧倩 郑燕 张跃明★

目的 探讨金匮肾气丸对糖尿病（DM）大鼠肾小管细胞凋亡及蛋白Bcl-2/Bax表达的影响。方法 采用小剂量高脂、高糖喂养联合腹腔注射链脲佐菌素30mg/kg造成2型糖尿病（DM）大鼠模型，金匮肾气丸溶液［800mg/（kg·d）］灌喂8周。8周后实施开腹手术取左肾组织，采用免疫组化检测肾组织Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果 与正常对照组比较，糖尿病组和金匮肾气丸治疗组肾脏细胞Bax和Bcl-2表达均增强，Bcl-2/Bax明显降低（P＜0.05），金匮肾气丸治疗组较糖尿病组Bax表达减弱，Bcl-2表达增强，Bcl-2/Bax增加（P＜0.05）。结论 金匮肾气丸可能通过影响凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达而抑制肾脏细胞凋亡，从而发挥肾脏保护作用。

糖尿病肾病 金匮肾气丸 细胞凋亡 Bcl-2 Bax

糖尿病肾病（diabetes nephropathy，DN），又称肾小球硬化症，是糖尿病最常见和严重的微血管并发症之一。研究表明，细胞凋亡密切参与了DN的发生［1］。金匮肾气丸由东汉医圣张仲景创制，记载于《金匮要略》，是治肾气不足诸证的第一方。近年来发现其在DN的治疗中起着重要作用［2］。而关于金匮肾气丸对糖尿病肾脏细胞凋亡的报道不多。本实验自2014年11月至2015年10月研究金匮肾气丸的抗凋亡作用并探讨其防治 DN的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 8周龄健康Wistar大鼠，雄性，体重200～250g，由浙江中医药大学动物实验中心提供。

1.2 材料 链脲佐菌素（STZ），美国SIGMA公司；金匮肾气丸（北京同仁堂科技发张股份有限公司制药厂）；Bcl-2和Bax免疫组化试剂盒（武汉博士德生物技术有限公司）；血糖仪（强生公司稳豪倍优型产品）。

1.3 分组、造模与给药 21只8周龄Wistar大鼠，随机分为正常组、糖尿病组（模型组）、金匮肾气丸组（治疗组），每组7只。给予普通饲料。对B、C组大鼠只给予高脂、高糖喂养（10%猪油，20%蔗糖，2.5%胆固醇，1.0%胆酸盐，66.5%常规饲料），喂养6周后，禁食12h，腹腔注射30mg/kg STZ溶液，对照组注射等量枸橼酸缓冲液。3d后取尾静脉血测定血糖，随机血糖≥16.7mmol/L，为2型糖尿病模型成功。成模后各组大鼠继续原饲料喂养控制血糖，C组采用适量金匮肾气丸［800mg/（kg·d）］溶液（溶于生理盐水）灌喂，A、B组用等量生理盐水灌喂，各8周。

1.4 肾组织切片制备 处死动物，摘取动物肾脏于福尔马林中固定，常规石蜡包埋，切片，用于肾脏细胞凋亡以及Bcl-2与Bax表达检测。

1.5 免疫组化法检测肾脏Bcl-2与Bax蛋白的表达 操作按说明书，一抗为兔抗大鼠的Bcl-2和Bax单克隆抗体（1：50稀释），二抗为生物素化羊抗兔IgG（1：100稀释），以PBS代替一抗作阴性对照，DAB显色，光镜观察，以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。在每张切片上随机选择10个区域，每个区域计数100个细胞，统计出每组切片Bcl-2、Bax阳性细胞百分数［3］。

1.6 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件包。计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各组大鼠肾组织Bcl-2、Bax阳性细胞百分数及Bcl-2/Bax比值变化情况 与A组比较，B组大鼠肾脏Bcl-2、Bax表达明显增多（P＜0.05），Bcl-2/Bax比值明显降低（P＜0.05）；C组与B组比较，C组Bax表达减少（P＜0.05），而Bcl-2表达、Bcl-2/Bax比值均明显增加（P＜0.05）。见表1。

表1 各组Bcl-2，Bax阳性细胞百分数及Bcl-2/Bax比值变化（±s）

表1 各组Bcl-2，Bax阳性细胞百分数及Bcl-2/Bax比值变化（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与糖尿病组比较，#P＜0.05

组别nBcl-2（%）Bax（%）Bcl-2/Bax正常组72.09±0.1201.61±0.0691.3±0.084模型组720.85±1.233*36.94±1.272*0.57±0.041*治疗组732.97±1.934*#29.20±2.351*#1.14±0.111*#

3 讨论

DN作为糖尿病常见而难治的微血管并发症，也是糖尿病患者致残和致死的主要原因之一［4］。细胞凋亡在DN发生发展中的作用逐渐受到重视［3～6］，较多文献报道糖尿病肾病的发生发展与肾小管细胞凋亡密切相关［7］。

细胞凋亡又称程序性细胞死亡（progranmaed cell death，PCD），指细胞基因调控的一种自主性的自杀现象，是一种细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身程序，自我结束生命的方式［8］。细胞凋亡的发生是由体内的凋亡分子所介导。Bcl-2及Bax是调节细胞凋亡的一组基因［9］，Bcl-2是一种重要的细胞生存基因，功能主要是抑制细胞凋亡，Bax是拮抗Bcl-2的促凋亡因子，细胞内bax和bcl-2的比例调节了细胞凋亡的发生［10～12］。

金匮肾气丸由干地黄、山药、山茱萸、泽泻、茯苓、丹皮、附子、桂枝八味药组成。由东汉医圣张仲景创制，记载于《金匮要略》，是治疗肾气不足诸证的第一方。张仲景用其来治疗多种病证，其中之一便是“男子消渴，小便反多，以饮一斗者，小便一斗”。金匮肾气丸滋肾阴而补肾阳，以阴中求阳而达到阴阳互生的目的［13］。DN为慢性消耗性疾病，久病损耗肾中精气。金匮肾气丸填补肾中真阴真阳，恢复气血阴阳平衡，从根本上保护了肾功能。本实验通过金匮肾气丸干预糖尿病大鼠8周后发现，肾脏细胞凋亡数目减少，Bcl-2表达量和Bcl-2/Bax明显增加，而Bax表达水平明显降低，说明金匮肾气丸可能通过改变凋亡基因Bcl-2和Bax的表达，升高Bcl-2/Bax的比值抑制糖尿病肾脏细胞凋亡，从而起到保护肾脏的作用。

本实验通过对Bcl-2和Bax的分析，发现肾脏细胞的凋亡参与了糖尿病肾脏病变的发生发展，同时金匮肾气丸可以通过抑制糖尿病大鼠肾脏细胞的凋亡，延缓糖尿病大鼠肾脏病变的发生和发展，对今后金匮肾气丸用于治疗DN具有重要的临床意义。

1 Soldatos G， Cooper M E. Diabetic nephropathy： important pathophysiologic mechanisms.Diabetes Res Clin Pract，2008，82（Suppl 1）：S75～79.

2 金智生，陈雪，李甜.金匮肾气丸对实验性2型糖尿病肾病大鼠血清TGF-β1、CTGF的影响.中医药学报，2012，40（3）：136～139.

3 姜栋栋，李文通，张伟栋.前列地尔调节bcl-2，bax抑制大鼠糖尿病肾病肾小管细胞凋亡.Acta Acad Med Weifang，2011，33（2）：146～148.

4 张艳玲，周波，张立净，等.中药治疗糖尿病生病的作用机制研究进展.中医药学报，2009，37（6）：105～108.

5 Chakradhar Velagapudi，Basant S.Bhandari，Sherry Abboud-Werner，et al.The Tuberin/mTOR pathway promotes apoptosis of tubular epithelial cells in diabetes.J Am Soc Nephro，2011，22（2）：262～273.

6 Wagrowska Danile M，Danile wicz M.A study of apoptosis in human glomerulonephritis as determine by in situ non-radioative labeling of DNA stand breaks.Acta Histochem，1997，99（3）：257～266.

7 Samy L Habib.Diabetes and renal tubular cell apoptosis.World Journal of Diabetes，2013，4（2）：27～30.

8 Hans I，Kim YS，Kim TH.Rore of apoptotic and necrotic cell death under physiologic conditions.BMB Rep，2008，41（1）：1～10.

9 Ortriz A，Ziyadeh FN，Neilson EG.Expression of apoptosis-regulatory gene in renel proximal tubular epithelial cells exposed to high ambient glucose and in diabetic kidneys.Invest Med，1997，45（2）：50～56.

10 赵燕，杨秋萍，肖华，等.灯盏花素对糖尿病大鼠肾脏细胞凋亡及bax、bcl-2表达的影响.中国糖尿病杂志，2009， 17（11）：864～867.

11 Mishra R，Emancipator SN，Kem T，et al.High glucose evokes an intrinsic proapoptotic signaling pathway in mesangial cells.Kidney Int，2005，67（1）：82～93.

12 孙洁，田林红，王收宝，等.黄苓苷对糖尿病大鼠肾脏细胞凋亡及其bcl-2和bax表达的影响.实用医学杂志，2001，23（5）：757～760.

13 王新玲，李月彩，侯颖春.金匮肾气丸抗自由基和细胞凋亡的作用.第四军医大学学报，2000，21（10）：1209～1211.

Objective To investigate the effects of Jinkui Shenqi Wan on the renal cell apoptosis in the diabetic rats. Methods Diabetic rat models were induced by high-lipids and high-sucrose feeding for a month and single intraperitoneal injection of streptozotocin（STZ），then were administrated with 800 mg/（kg·d）of Jinkui Shenqi Wan for 8 weeks.At week 8，rat left kidneys were taken and the change of Bcl-2/Bax was detected by immunohistochemistry. Results The level of Bcl-2，Bax protein and kidney tubules cells apoptosis index were higher，while Bcl-2/Bax ratio was lower in Jinkui Shenqi Wan and DM group than those in normal control group（P＜0.05）.The levels of Bcl-2 protein，Bcl-2/Bax ratio and kidney tubules cells apoptosis index were higher in Jinkui Shenqi Wan group than those in DM group（P＜0.05），and Bax expression level was reduced compared to that of DM group（P＜0.05）. Conclusion Jinkui Shenqi Wan may inhibit the apoptosis of renal ceils in diabetic rats by regulating the expressions of Bcl-2 and Bax.

Diabetes nephropathy Jinkui Shenqi Wan Cell apoptosis Bcl-2 Bax

浙江省大学生科技创新活动计划（2014R410007）

310000 浙江中医药大学