一株抗铅细菌的分离鉴定与抗铅性能研究

2016-09-12赵玲侠孙晓宇路鹏鹏沈卫荣

西北农业学报 2016年8期

关键词：重金属菌株培养基

瞿　佳, 赵玲侠, 孙晓宇, 陈　锐, 路鹏鹏，沈卫荣

(陕西省微生物研究所微生物资源中心，西安　710043)

一株抗铅细菌的分离鉴定与抗铅性能研究

瞿佳, 赵玲侠, 孙晓宇, 陈锐, 路鹏鹏，沈卫荣

(陕西省微生物研究所微生物资源中心，西安710043)

为获得可应用于农田土壤重金属污染治理的铅(Pb)降解功能菌株，从陕西商洛铅锌矿区周边农田土壤中分离筛选出1株抗铅细菌，命名为PS8，对其形态特征、生理生化、16S rDNA同源性及抗铅性能进行研究。结果表明，菌株PS8为革兰氏阴性细菌，菌落呈圆形、淡黄色；最适生长温度为30 ℃，最适pH为7.0；可还原亚硝酸盐，氧化酶、接触酶反应呈阳性；与粪产碱菌Alcaligenesfaecali高度同源；在Pb2+浓度为0.5和1.0 mmol/L时，去除率分别为99.08% 和97.24%。菌株PS8对重金属铅具有高抗性和较强降解能力，是高效、环境友好的土壤重金属铅污染微生物修复菌株。

抗铅微生物；产碱菌；鉴定；抗铅性能

土壤作为陆地生态系统的基础，是农业生产中不可替代的环境因子，也是食品安全和人体健康的重要保障。土壤修复在环境保护和维持生态平衡中具有重要作用[1-2]，随着矿产资源的开发利用，重金属污染物通过多种途径在土壤中积累，使土壤肥力下降，从而降低作物产量及品质。因此，重金属污染土壤的改良和修复，已成为当前农业可持续发展和土壤改良的研究热点[3-4]。铅(Pb)是一种典型的有毒、有害重金属。近年来，随着工业和科技的迅速发展，大量的铅被释放至土壤，造成土壤、水源等污染，对农业生产和环境安全形成极大的潜在威胁[5]。陕西商洛地区铅锌矿产资源丰富，但因前期规划布局不合理，大量开采及尾矿处理不当，造成严重的土壤重金属污染和环境破坏。因此，针对当地铅锌矿区土壤和重金属污染修复研究迫在眉睫。

目前，国内外有关重金属耐受性微生物的分离修复应用研究较常见，如Park等[6]发现细菌可以固定土壤中的铅；同时，分离自铅污染水中的耐性菌株还可有效修复污染水体[7]。因此，利用活体微生物作为生物制剂进行土壤修复在重金属土壤污染治理中应用前景广阔[8]。

本研究从陕西商洛某铅锌矿区周边农田土壤中分离获得1株抗铅细菌PS8，根据其形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析，初步鉴定为粪产碱菌Alcaligenesfaecalis，命名为AlcaligenesfaecalisPS8。该菌株对铅的抗性显著，可有效去除土壤中的铅离子，是今后农田土壤环境修复的重要研究材料。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

含铅土壤样品采自陕西省商洛市商州区黑龙口镇铅锌矿区周边农田，取0～15 cm土样25 g，装入无菌样品袋，带回室内4 ℃保存，备用。

LB培养基：NaCl 10.0 g，酵母浸粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，去离子水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃、30 min湿热灭菌；制备固体培养基需加入20 g/L琼脂；所用试验材料均购于北京奥博星生物技术有限责任公司。

重金属溶液：用去离子水将Pb(NO3)2配制成Pb2+浓度为2.0 mol/L的母液，待用，121 ℃、30 min灭菌[9]。

化学试剂购于天津天力化学试剂有限公司，标准菌株ATCC15554由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供。

1.2主要仪器

隔水式培养箱GH500(北京科伟永兴仪器有限公司)，摇瓶培养箱TS-2102(上海天呈实验仪器制造有限公司)，立式压力蒸汽灭菌锅LDZX-50KBS(上海申安医疗器械厂)，高速冷冻离心机GL-20G-H(上海安亭科学仪器厂)，722型紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)，原子吸收光谱仪(Thermo Fisher iCE3000)，基因扩增仪(TProfessional Standard Gradient 96)。

1.3抗铅微生物的分离筛选

取5 g土样于45 mL生理盐水，制成土壤悬液。取1 mL土壤悬液加入含2.0 mmol/L Pb2+的液体培养基，30 ℃、150 r/min摇床培养3 d。取1 mL培养液转接至新鲜含2.0 mmol/L Pb2+的液体培养基，如此转接3次后获得稳定抗铅微生物，在固体培养基上划线纯化，对分离纯化的菌株进行编号。将分离纯化的菌株分别划线于Pb2+浓度为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 mmol/L的固体培养基平板，观察菌落生长状况。

1.4抗铅菌株的鉴定

将筛选得到的菌株划线接种于固体培养基平板，30 ℃培养72 h，观察菌落形态，并进行革兰氏染色鉴定。

1.5生理生化鉴定

将筛选得到的菌株划线接种于固体培养基平板，选取28、30、32、35、37、40 ℃作为培养温度，观察在不同培养条件下，菌株的最适生长温度。分别检测接种于pH为3、4、5、6、7、8、9的液体培养基，经30 ℃、150 r/min 培养24 h的菌液的OD600值。参照《常见细菌鉴定手册》对筛选得到的菌株进行氧化酶、吲哚产生、脲酶、硝酸盐利用、亚硝酸盐利用、淀粉酶、明胶液化等试验[10]，以标准菌株ATCC15554为对照。

1.6抗铅细菌系统发育学分析

参照《分子克隆实验指南》提取菌株PS8的基因组DNA[11]。16S rDNA基因 PCR 扩增引物为：27-F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′；1492-R，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃ 退火45 s，72 ℃延伸2 min，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。

基因扩增产物纯化后由生工生物工程(上海)股份有限公司测序，将所得序列与GenBank数据库已有细菌的16S rDNA序列进行Blast相似性比对分析，通过ClustalX 和 MEGA5 .1软件的N-J法构建系统发育树[12]。

1.7不同Pb2+浓度下抗铅细菌生长曲线的绘制

选取筛选到的高抗铅菌株PS8，将1 mL新鲜菌株种子液接种于100 mL Pb2+浓度分别为0、0.5、1.0 mmol/L的LB液体培养基，30 ℃、150 r/min离心，每隔4 h分别测定其OD600值，每组处理设置3个重复。以培养时间为横坐标，OD600为纵坐标，绘制不同Pb2+浓度菌株PS8的生长曲线。

1.8抗铅细菌PS8去除铅离子的性能研究

配制Pb2+浓度分别为0.5和1.0 mmol/L 的LB液体培养基，并分别将1 mL新鲜菌株种子液接种于100 mL培养基，对照组不接种菌。摇床培养3 d后，10 000 r/min离心5 min去除菌体，收集上清液，通过原子吸收仪测定样品中铅的浓度。每份样品设3个重复。Pb2+去除率(P)计算公式：P= (C0-C)/C0× 100%，式中，C0为原培养液中Pb2+浓度(mmol/L)，C为菌体生长后培养液中Pb2+浓度(mmol/L)。

1.9数据处理与分析

采用ClustalX 1.83 和 MEGA5.1软件进行细菌系统发育学分析并构建进化树；采用SPSS 22.0软件进行去除铅离子性能分析和统计学分析；采用Microsoft Excel 2007软件绘制细菌生长曲线。

2　结果与分析

2.1抗铅菌株的分离筛选

根据菌落形态，在含2.0 mmol/L Pb2+的培养基平板上挑选出生长良好的不同类型细菌53株。将以上菌株划线接种于不同浓度梯度的培养基平板，其中能在3.0 mmol/L Pb2+培养基平板上生长的菌株27株，能在4.0 mmol/L Pb2+培养基平板上生长的菌株16株，能在4.5 mmol/L Pb2+培养基平板上生长的菌株8株，能在5.0 mmol/L Pb2+培养基平板上生长的菌株1株，即PS8。因此，选择菌株PS8进行下一步研究。

2.2抗铅菌株的鉴定

经鉴定，在LB固体培养基上，PS8菌株菌落呈淡黄色、圆形、较小，表面不光滑，较粘稠，不透明，易挑取，菌落直径5～10 mm。革兰氏染色阴性，无芽孢，菌体大小约0.5～1.0 μm，杆状或圆杆状。

2.3生理生化特征分析

研究表明，抗铅菌株PS8在28～37 ℃均可生长，最适温度为30 ℃；当温度达到或超过37 ℃时，出现明显的生长抑制作用。同时，菌株PS8在pH为5～9时可正常生长，最适pH为7.0。当pH<5时，菌体基本不生长。

以标准菌株ATCC15554为对照进行生理生化鉴定试验。结果表明，菌株PS8与标准菌株ATCC15554生理生化特性相同：氧化酶反应呈阳性，接触酶反应呈阳性，糖发酵试验、吲哚检测试验、脲酶检测试验、V-P试验、M-R试验、明胶液化试验、淀粉水解试验均呈阴性(表1)。

表1　菌株PS8的生理生化特征

注：+为阳性；-为阴性。

Note：+ Positive；- Negative.

2.4抗铅菌株的系统发育学分析

将菌株PS8的16S rDNA 序列(扩增长度为1 411 bp)通过GenBank数据库进行序列分析和同源性比对，结果表明，菌株PS8序列与Alcaligenesfaecalis的16S rDNA序列同源性达99%(图1)；结合生理生化鉴定结果，将其命名为AlcaligenesfaecalisPS8。序列已提交至 NCBI 的GenBank数据库，登录号为KM108309。

2.5不同 Pb2+浓度下菌株的生长曲线

菌株PS8培养于未加Pb2+的对照组(0 mmol/L Pb2+)时，最大OD600值为1.635；当Pb2+浓度分别为 0.5、1 mmol /L时，菌株PS8生长曲线与对照组基本相同，仅在0～4 h表现出一定程度的延滞，最大OD600值分别为1.384和1.064(图2)，表明菌株PS8生长没有受到Pb2+影响。

2.6菌株铅去除性能分析

经菌株PS8处理后，Pb2+浓度由0.5和1.0 mmol/L分别降为(4.8±0.65) μmol/L和(27.66±0.41) μmol/L，去除率分别为99.08% 和97.24%，表明菌株PS8可以显著去除土壤中的Pb2+。随着Pb2+浓度的升高，菌株PS8对Pb2+的去除率呈逐渐下降趋势，但均高于95%。

图1　菌株PS8的16S rDNA序列的系统发育树

图2　不同Pb2+浓度菌株PS8的生长曲线

3　结论与讨论

农业生产中，因农田灌溉、化肥农药的大量使用、固体废弃物污染以及矿山开采等的影响，作为农田生态系统载体的土壤受到的重金属污染日益严重[13]。传统处理重金属的方法包括化学沉淀、离子交换、溶剂提取等，然而这些技术在修复土壤重金属的过程中存在效率低、成本高、易产生二次污染等缺点，不宜作为降解土壤重金属的长效处理方法[13-14]。研究表明，利用微生物降解土壤中的重金属离子主要有以下几种方式：通过吸附作用、富集作用活化重金属降解[15]；自身代谢产生有机酸、氨基酸、酶络合或者氧化还原重金属矿物、改变重金属与土壤结合形态[16-17]；产生化学螯合剂、表面活性剂[18-19]，与环境植物协同作用[20]等。由于微生物具有生长周期短、繁殖力强、取材简易等特点，近年来，利用环境友好型微生物处理土壤重金属的技术发展迅速[21]。因而，有针对性的研究筛选抗重金属菌种，可以为农田土壤环境重金属修复提供重要的试验材料和理论依据[14, 22-23]。

本研究从陕西商洛铅锌矿区周边农田土壤中筛选出1株高抗铅细菌PS8，该菌适宜生长温度为28～37 ℃，最适温度为30 ℃，适宜生长pH为5～9，最适pH为7.0。通过形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列系统发育分析，初步鉴定其为粪产碱菌，命名为AlcaligenesfaecalisPS8。该菌株在不同Pb2+浓度下的生长曲线不同，且随着Pb2+浓度的增大其生长虽受到一定程度的抑制，然而在高浓度Pb2+下，仍能进行正常的新陈代谢活动，表明其具有一定的抗铅能力。且当培养液中加入Pb2+时，菌株的适应期延长，该作用与重金属铅对微生物的毒害作用有关[23]。虽然菌株PS8在生长初期受Pb2+抑制，随后便表现出一定的耐受适应性，稳定生长。在液体培养条件下，菌株PS8对Pb2+具有极强的去除能力，可能是由于菌株细胞表面存在Pb2+吸附位点或阳离子转运系统，重金属离子可以与菌体表面的转运蛋白结合，在细胞内螯合降解或富集形成特定形态的重金属化合物，使其不会重新被释放至土壤，随后可以通过收集菌体、洗涤、解析离心回收重金属离子[24-25]。同时，也可结合微生物-植物共存体系，提高根系土壤重金属富集量，通过植物代谢作用吸收重金属离子，增加降解效率。

在利用微生物处理土壤重金属的研究中，因环境气候特征、土壤状况、农作物种类等的影响，微生物制剂在不同环境中降解土壤重金属的应用效力存在一定差异[18,21]。因此，研发高效、环境适应性强的微生物菌剂并联合植物降解土壤重金属，还有待进一步研究。

Reference：

[1]串丽敏,赵同科,郑怀国.等.土壤重金属污染修复技术研究进展[J].2014,37(120):213-222.

CHUAN L M,ZHAO T K,ZHENG H G,etal.Research advances in remediation of heavy metal contaminated soils[J].EnvironmentalScience&Technology,2014,37(120):213-222 (in Chinese with English abstract).

[2]余志,黄代宽.重金属污染土壤修复治理技术概述[J].环境科技,2013,19(4):46-48.

YU ZH,HUANG D K.Overview of remediation of heavy metal pollution in soil[J].EnvironmentalProtectionandTechnology,2013,19(4):46-48 (in Chinese with English abstract).

[3]佟洪金,涂仕华,赵秀兰.土壤重金属污染的治理措施[J].西南农业学报,2003,16(S1):33-37.

TONG H J,TU SH H,ZHAO X L.Countermeasure technology in heavy metal contaminated soils[J].SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences,2003,16(S1):33-37 (in Chinese with English abstract).

[4]王萌萌,周启星.生物炭的土壤环境效应及其机制研究[J].环境化学,2013,32(5):768-780.

WANG M M,ZHOU Q X.Environmental effects and their mechanisms of biochar applied to soils [J].EnvironmentalChemistry,2013,32(5):768-780 (in Chinese with English abstract).

[5]金羽,曲娟娟,李影,等.一株耐铅细菌的分离鉴定及其吸附特性研究[J].环境科学学报,2013,33(8):2248-2255.

JIN Y,QU J J,LI Y,etal.Isolation,identification and Pb (Ⅱ) biosorption characterization of a lead-resistant strain[J].ActaScientiaeCircumstantiae,2013,33(8):2248-2255 (in Chinese with English abstract).

[6]PARK J H,BOLAN N,MEGHARAJ M,etal.Bacterial-assisted immobilization of lead in soils:implications for remediation[J].Pedologist,2011,54(3):162-174.

[7]CHATTERJEE S,MUKHERJEE A,SARKARA,etal.Bioremediation of lead by lead-resistant microorganisms,isolated from industrial sample[J].AdvancesinBioscienceandBiotechnology,2012,3(3):290-295.

[8]彭建,蒋一军,吴建生,等.我国矿山开采的生态环境效应及土地复垦典型技术[J].地理科学进展,2005,24(2):38-48.

PENG J,JIANG Y J,WU J SH,etal.Eco-environmental effects of mining and related land reclamation technologies in China [J].ProgressinGeography,2005,24(2):38-48 (in Chinese with English abstract).

[9]肖琳,杨柳燕,尹大强,等.环境微生物实验技术[M].北京:中国环境科学出版社,2004:253-259.

XIAO L,YANG L Y,YIN D Q,etal.Environmental Microbiology Experimental Technology [M].Beijing:China Environmental Science Press,2004:253-259 (in Chinese).

[10]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001:162-364.

DONG X ZH,CAI M Y.Manual of Systematic Determination General Bacteriology [M].Beijing:Science Press,2001:162-364 (in Chinese).

[11]萨姆布鲁克 J,拉塞尔 D W.黄培堂,等译.分子克隆实验指南[M].第3版.北京:科学出版社,2008:26-32.

SAMBROOK J J,RUSSELL D W.HUANG P T,etal.Molecular Cloning:a Laboratory Manual[M].3rd ed.Beijing:Science Press,2008:26-32 (in Chinese).

[12]TAMURA K,DULLEY J,NEI M,etal.MEGA4:molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software verison 4.0 [J].MolecularBiologyEvolution,2007,24(8):1596-1599.

[13]杨科壁.中国农田土壤重金属污染与其植物修复研究[J].世界农业,2007(8):58-61.

YANG K B.Study on heavy metal pollution and Phytoremediation of farmland soils in China[J].WorldAgriculture,2007(8):58-61(in Chinese).

[14]刘爱民,黄为一.镉铜污染尾矿土中添加耐镉铜菌剂J5后微生物区系多样性的变化[J].生态毒理学报,2006,1(3):265-270.

LIU A M,HUANG W Y.Study on the change of microbial community diversity in contaminated soils of cadmium-copper mine tailings after the tolerant-cadmium and tolerant-copper strain J5 added[J].AsianJournalofEcotoxicology,2006,1(3):265-270 (in Chinese with English abstract).

[15]盛下放,白玉,夏娟娟,等.镉抗性菌株的筛选及对番茄吸收镉的影响[J].中国环境科学,2003,23(5):467-469.

SHENG X F,BAI Y,XIA J J,etal.Screen out of cadmium-resistance strains and their effect on cadmium uptake by tomato [J].ChinaEnvironmentalScience,2003,23(5):467-469 (in Chinese with English abstract).

[16]KALINOWSKI B E,LIEMANN L J,BRANTLEY S L,etal.X-ray photoelectron evidence for bacteria enhanced dissolution of homblende [J].GeochimicaetCosmochimicaActa,2000,64(4):1331-1343.

[17]FRANCIS A J,DODGE C J.Anaerobic microbial dissolution of transition and heavy metal oxides [J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,1988,54(4):1009-1014.

[18]HSIAO K H,KAO P H,HSEU Z Y.Effect of chelators on chromium and nickel uptake byBrassicajunceaon serpentine-mine tailings for phytoextraction [J].JournalofHazardousMaterials,2007,148(1):366-376.

[19]叶和松,盛下放,江春玉,等.生物表面活性剂产生菌的筛选及其对土壤重金属的活化作用[J].环境科学学报,2006,26(10):1631-1636.

YE H S,SHENG X F,JIANG CH Y,etal.The isolation of biosurfactant- producing bacteria and their effect on the availability of lead in soil [J].ActaScientiaeCircumstantiae,2006,26(10):1631-1636(in Chinese with English abstract).

[20]BELIMOV A A,HONTZEAS N,SAFRONOVA V I,etal.Cadmium- tolerant plant growth-promoting bacteria associated with the roots of indian mustard (BrassicajunceaL.Czem)[J].SoilBiologyandBiochemistry,2005,37(2):241-250.

[21]CARLOS G,ITZIA A.Phytoextraction:a cost-effective plant based technology for the removal of metals from the environment [J].BioresourceTechnology,2001,77(3):229-236.

[22]夏娟娟,盛下放,江春玉.重金属镉抗性菌株的筛选及其对镉活化作用的研究[J].生态学杂志,2005,24(11):1357-1360.

XIA J J,SHENG X F,JIANG CH Y.Screening of cadmium-resistant strains and their effects on cadmium activation[J].ChineseJournalofEcology,2005,24(11):1357-1360(in Chinese with English abstract).

[23]江春玉,盛下放,何林燕,等.一株铅镉抗性菌株WS34的生物学特性及其对植物修复铅镉污染土壤的强化作用[J].环境科学学报,2008,28(10):1961-1968.

JIANG CH Y,SHENG X F,HE L Y,etal.Isolation and characteristics of heavy metal-resistant strain WS34 and its effects on the phytoremediation of soils contaminated with lead and cadmium[J].ActaScientiaeCircumstantiae,2008,28(10):1961-1968 (in Chinese with English abstract).

[24]江春玉.重金属铅镉抗性菌株的筛选、生物学特性及其强化植物修复铅镉污染土壤的研究[D].南京:南京农业大学,2005.

JIANG CH Y.Screening of heavy metal-resistant strains and their biological characteristics and effects on the phytoremediation of soils contaminated with lead and cadmium [D].Nanjing:Nanjing Agricultural University,2005(in Chinese with English abstract).

[25]RAJKUMAR M,FREITAS H.Effects of inoculation of plant growth promoting bacteria on Ni uptake by Indian mustard [J].BioresourceTechnology,2008,99(9):3491-3498.

Corresponding authorSHEN Weirong, male, research fellow. Research area: environmental microbiology and applied microbiology. E-mail: shenweirong@21cn.com

(责任编辑：郭柏寿Responsible editor:GUO Baishou)

Isolation, Identification of a Lead-resistant Strain and Effect of Lead Removal

QU Jia, ZHAO Lingxia, SUN Xiaoyu, CHEN Rui,LU Pengpeng and SHEN Weirong

(Microbial Resource Center, Microbiology Insititute of Shaanxi, Xi’an710043, China)

In order to obtain resistant bacteria for removing heavy metal in polluted cultivated field, a lead-resistant strain, named PS8, was isolated from metal-polluted soil in a cultivated field near lead-zinc mining area in Shangluo, Shaanxi province. Based on 16S rDNA sequence analysis, PS8 was highly homologous toAlcaligenesfaecaliby studying the morphological, physiological-biochemical properties, the results showed that PS8 was gram negative, circle-shaped, yellow color and its most suitable growth condition was 30 ℃ pH 7.0. In addition, Nitrite reduction test, oxidase test and catalase test were all positive. The Pb2+removal effect of PS8 was 99.08% and 97.24% respectively in 0.5 mmol/L and 1.0 mmol/L lead concentrations. In conclusion, PS8 is an effective, environmental- friendly strain and have remarkable value to remediate heavy metal contaminated soil.

Lead resistant bacteria;Alcaligenes; Identification; Removal capacity

2016-02-02Returned2016-04-27

Shaanxi Youth Science and Technology Foundation (No. 2014k-34).

QU Jia, female, master,research assistant. Research area: environmental microbiology. E-mail: q_jia@163.com

2016-02-02

2016-04-27

陕西省科学院青年人才培养专项(2014K-34)。

瞿佳，女，硕士，研究实习员，从事资源环境微生物的研究与应用工作。E-mail：q_jia@163.com

沈卫荣，男，研究员，主要从事微生物菌种选育、发酵工程等研究及产业化开发工作。 E-mail：shenweirong@21cn.com

Q939.1；Q789

1004-1389(2016)08-1195-06

网络出版日期：2016-07-14